【纯干货】你对你用的载体了解吗？+惊喜小彩蛋之载体图谱怎么看

2023-08-24 03:24| 来源: 网络整理| 查看: 265

每个实验室都有各种各样的载体，每个实验阶段也在使用不同的载体。那么，你对你使用的载体了解多少呢？小编随机采访了几个生物专业的硕士同学：同学 A（做大肠表达）： pGEX-4T-2 载体，大肠表达载体，大小约为 5 kb，抗性为 Amp，带有 GST 标签，有 BamHI 以及 EcoRI 酶切位点.....我：那...有看过图谱吗？同学 A：木有 (ｷ｀ﾟДﾟ´)!!同学 B（做酵母表达）： pPICZα/A 载体，毕赤酵母表达载体，大小约为 3.5 kb，抗性为 Zeocin同学 C（做大肠表达）：pET-28a(+)，载体，大肠表达载体，大小约为 5.4 kb，抗性为 Kana，6xHis 标签...然而，他们都没有看过载体图谱!其实，在小编眼里面的载体是这样的：比如，pET-28a(+)：首先它是大肠表达载体，大小为 5 369 bp，胞内表达目的基因之后，我们对其元件进行一个一个的分析：

复制子：ColE1/pMB1/pBR322/pUC ori——起始载体的复制；f1 ori——f1 噬菌体复制子，显示正义链合成方向 KanR：编码氨基糖苷磷酸转移酶，在原核细胞中产生卡那霉素抗性，在真核细胞中产生遗传霉素筛选标记 Rop：编码 ROP 蛋白，使得质粒维持低拷贝水平乳糖操纵子元件——lacI promoter+ lacI（启动阻遏蛋白的表达，是 lac operator 的抑制因子），lac operator（lac 操纵基因，阻遏蛋白与之结合后抑制其后基因的表达，乳糖类似物 IPTG 可与阻遏蛋白结合从而失去对 lac operator 的控制，进而使得其后基因正常表达） T7 promoter：受控于 T7 RNA 聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5 倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过 T7 表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。 6xHis（6xHis 亲和标签）：MCS 区 C 端和 N 端各有一个，编码 6 个连续的 His，用来作为纯化目标蛋白的标签 throbin site：Thrombin 蛋白酶切位点 T7 tag：提升翻译效率 MCS：多克隆位点区域 T7 terminator：受控于 T7 RNA 聚合酶的终止子接下来是第二个，pPICZα/A：

首先，它是毕赤酵母表达载体，大小为3593 bp整合型载体（将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达），可将目的蛋白分泌到胞外。 ori：ColE1/pMB1/pBR322/pUC 复制子：起始载体的复制 AOX1 promoter：甲醇诱导型启动子，表明载体需要甲醇诱导才可表达 α-factor secretion signal：分泌信号肽，使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外 MCS：多克隆位点 Myc：载体标签，有对应抗体，可用于做 western-blot 杂交应用中。 6xHis：（6xHis 亲和标签）：MCS 区 C 端和 N 端各有一个，编码 6 个连续的 His，用来作为纯化目标蛋白的标签 AOX1 terminator：转录终止子 TEF1 promoter：EF-1α 启动子-在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达 EM7 promoter：细菌启动子-在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达 BleoR：Zeocin 抗性基因 CYC1 terminator：转录终止子当然，有时候并不需要你这么仔细的去分析载体。但是对于载体的基本元件还是要知悉的，比如载体启动子，抗性元件，多克隆位点，载体标签。当你看懂了这些元件后，你就会懂得为什么这个载体是诱导型载体，又为什么这个载体可以用XX标签纯化等等。但是有很多小伙伴表示不会看载体图谱，那么小编就来分享一下多年以来的经验。准备工作：

2.确定了载体之后：

丰晖生物提供细胞系、原代细胞、质粒载体、菌株、cDNA克隆、ORF克隆等产品销售及实验服务

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