研究 SNP 基因分型有哪些方法？

SNP，全称 Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个 SNP 位点都可以有 4 种不同的变异形式, 但实际上发生的只有两种, 即转换和颠换, 二者之比为 2：1。SNP 在 CG 序列上出现最为频繁, 而且多是 C 转换为 T , 原因是 CG 中的胞嘧啶常被甲基化, 而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。

一般而言,SNP 是指变异频率大于 1 % 的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每 1000 个碱基就有一个 SNP , 人类基因组上的 SNP 总量大概是 3 ×10^6 个 。因此,SNP 成为第三代遗传标志, 人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与 SNP 有关。

SNP 根据其在基因中的位置，可以分为基因编码区、基因非编码区、基因间隔区（基因之间的区域）。由于基因序列的兼并性，编码序列中的 SNP 不一定会改变蛋白的氨基酸序列。编码区的 SNP 有两种类型: 同义和非同义。同义单核苷酸多态性并不影响蛋白质序列，而非同义的则会改变蛋白质的氨基酸序列。

而不在蛋白质编码区的 SNP 仍可能影响基因剪接、转录子结合、信使 RNA 降解或非编码区的 RNA 序列。受到这种单核苷酸多态性（SNP）影响的基因表达被称为单核苷酸多态性表达（ESNP），可能发生在此基因的上游或下游。

直接测序法

目前很多朋友在研究 SNP 位点的时候，仍然在选用直接测序法，Sanger 测序原理为双脱氧终止法，会忠实的延伸出模板链上的碱基序列，在毛细管电泳中会依次收集各个碱基的荧光信号，SNP 则会在测序结果中出现如下套峰的情况，示例如下：

图片来源：Google

优点：直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的 SNP 分型方法，适用于发现未知 SNP 位点，检测少量样本，少量位点的碱基多态性。

缺点：通量太低，且成本较高，但是随着现在高通量的测序技术的飞速发展，目的片段甚至全基因组的高通量测序也让直接测序法重新焕发活力！

片段长度多态性法

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）是一种较早的进行 SNP 分型的技术，简单来说就是在包含 SNP 位点的序列中存在有特定的限制性内切酶酶切位点，而 SNP 位点基因型的改变则会使该酶切位点失效，这样根据酶切之后 PCR 片段长度的多态性即可得知对应的基因型，下面用一张图片来示意该方法的实验流程：

如上图所示，三种基因型的结果条带数目不一致，可以比较容易判读样本的基因型。

优点：适合小批量样本的分型实验，不需要特殊的仪器，只需要一台 PCR 仪以及电泳仪器即可；

缺点：通量小且对于位点要求高（需要特定的酶切位点），且没法儿准确的鉴别假阳性的情况（酶切不完全）。

针对上述情况，如果是没找到合适的酶切位点，或者说存在的酶切位点所需要的内切酶成本较高，可以通过在 PCR 引物上引入错配，得到理想的酶切位点；

其次，为了增大该种方法的检测精确性，一种方法是在 PCR 产物中选择一个内参酶切位点（与目标酶切位点一致，用以检测酶切是否完全），第二种方法就是改进出了荧光酶切方法，即在 PCR 的产物上添加上荧光，通过测序仪收集荧光信号，报告产物的长度，该种方法的优势在于毛细管电泳的精确性更高，分辨率更大，同时可以混合上样，降低实验分型的成本，提高效率。

飞行质谱法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技术的 SNP 分型原理是：先通过 PCR 扩增目标序列，然后加入 SNP 序列特异延伸引物，在 SNP 位点上延伸 1 个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管, 而后用瞬时纳秒（10 - 9s）强激光激发，基质分子吸收辐射能量，导致能量蓄积并迅速产热，使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率的不同得以分离，在真空小管中飞行到达检测器。

MALDI 产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight，TOF）检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。利用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开，推导出 SNP 分型。

优点：成本较低，不需要合成特殊的荧光引物，只需要一对 PCR 引物以及延伸引物即可；检测方便，灵敏度高，数据准确性有保证；

缺点：对于 SNP 位点两侧序列要求较高，存在特殊序列，如 SNP 位点，插入缺失等会影响准确性，另外，对于样本质量稍微有些高，补数据较为麻烦，如果样本质量不是很好的，建议谨慎选用；最后一点是检测成本低是基于位点数以及样本数较多的情况而言，目前市面上的公司一般是 25 - 30 个位点一个体系，384 孔板为一个反应收费。

Taqman 荧光探针法

Taqman 探针想必各位都不陌生，原理介绍如下：

该技术是由 ABI 研发的 SNP 分型技术，其技术原理如下：PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的 MGB 特异探针来识别不同等位基因（allele1 和 allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher)。PCR 过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。

特异的探针与相应的等位基因结合后，DNA 聚合酶发挥 5’到 3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离 3’端淬灭荧光基团的淬灭作用（quench），从而发出荧光。两个探针的 5’端标有不同的荧光（FAM 或 VIC），3’端标有 MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应样本的 SNP 等位基因型。

上图右侧即为 Taqman 实验分型后的结果图，以上，蓝色和红色代表两种纯合子，右上角的绿色则为杂合子，左下角的黑色为 NTC，其余地方散落的黑色的点则为由于样本原因无法准确分型的结果。

优点：操作简单，准确性高，判读也很方便，认可度高；

缺点：探针合成耗时较长，一般为 ABI 公司合成，从我自己的经历讲，国内合成的探针质量不稳定，价格偏高，通量小，一般为 1 - 2 个位点适用，对于样本的质量要求较高，除了样本无降解外，还需要浓度尽可能的一致，这样结果才会比较集中。

多重 SNaPshot 检测方法

SNaPshot 技术又称为小测序技术，是由美国应用生物公司 (ABI) 开发的主要针对中等通量 (