猪业科学

摘要

非洲猪瘟是世界动物卫生组织（OIE）的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，自2018年传入我国以来，对我国的养殖业造成巨大的冲击。pp220蛋白是非洲猪瘟病毒CP2475L基因编码的多聚蛋白前体，其经过酶解加工后形成病毒主要的结构蛋白。文章从生物信息学角度分析了pp220蛋白的基本理化特性、跨膜区、信号肽、优势B、T细胞抗原表位和构建了基于pp220蛋白的遗传进化树，通过分析结果，文章对非洲猪瘟病毒的基础数据进行了补充，以期能为非洲猪瘟防控提供基础信息和指引。

关键词

非洲猪瘟；CP2475L；pp220；生物信息学；B、T细胞抗原表位；进化树

非洲猪瘟自2018年传入中国以来，以极快的速度在国内传播，给中国生猪养殖业造成了数千亿元的经济损失，并且这一数字随着疫情形势在进一步扩大，对整个养殖环境的冲击和经济的深远影响非常之大。非洲猪瘟病毒的生存能力很强，一旦在一个区域出现，将会形成定植，所以如何防止、净化、根除非洲猪瘟是我国动物疫情防控的重中之重。非洲猪瘟的病原是非洲猪瘟病毒（Africa Swine Fevervirus，ASFV），CP2475L基因是非洲猪瘟病毒基因组中最大的一个基因，它是参与病毒核衣壳形成的重要基因，其编码蛋白为pp220蛋白（polyprotein220，多聚蛋白），经裂解加工后形成病毒主要的结构蛋白p150、p37、p34和p14，抑制CP2475L基因的表达将会导致病毒核衣壳和DNA的部分缺失，推测CP2475L基因可能具有衔接病毒核衣壳和囊膜的功能，pp220可能作为一个蛋白支架的作用，连接核衣壳和外部包膜。pp220对ASFV另一个多聚蛋白前体pp62的加工有重要作用，pp62的加工需要pp220表达的核心产物参与才能进行，而pp220和pp62这两个前体的加工又依赖于ASFV主要衣壳蛋白p72的表达，当p72的表达被敲除后，pp62和pp220会形成一个拉链状细长的膜结合蛋白结构，而pp220和pp62经加工之后的成熟产物共占ASFV粒子蛋白质量的30%左右，是核衣壳的重要组成部分，因此，多聚蛋白pp220和pp62对ASFV组装成熟有重要作用。目前对CP2475L基因编码蛋白pp220的研究数据较少，文章以非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/2018中国分离株为对象，从生物信息学角度对CP2475L基因编码的pp220多聚蛋白进行分析，为非洲猪瘟病毒的研究补充一些基础数据。

1  材料与方法

1.1  基因获取

Pig/HLJ/2018株非洲猪瘟病毒CP2475L基因位于病毒基因组117290bp~124720bp，其编码蛋白为pp220，蛋白序列获取于NCBI，GBID为QBH90580.1。

1.2  分析方法

1.2.1  pp220蛋白理化性质分析

利用ExPASy在线分析工具ProtParam对pp220的蛋白分子量、等电点、氨基酸结构、原子数、疏水性等理化性质进行分析。

1.2.2  蛋白跨膜区和信号肽分析

通过TMHMM-2.0在线服务器分析蛋白跨膜区，SignalP-5.0在线服务器分析蛋白信号肽。

1.2.3  蛋白抗原指数、亲水性、表面可及性、滴定曲线分析

采用Lasergene7.0Protean模块对蛋白抗原指数、亲水性、表面可及性、滴定曲线进行分析。

1.2.4  pp220优势B、T细胞抗原表位预测

采用NetSurfP-2.0在线服务器、PSRSM在线服务器分析蛋白序列二级结构，对2种方法分析结果进行综合，去除α-螺旋、β-折叠、β-转角等不易形成抗原表位的区域，筛选出易形成抗原表位的区域即为潜在优势表位区域。采用在线分析工具BepiPred1.0、IEDB分析序列B细胞抗原表位区域，两种方法分析结果综合得出B细胞抗原表位区域。采用NetMHC4.0在线服务器、NetMHCpan-4.1在线服务器分析序列T细胞抗原表位区域，物种选择猪，MHC种类的SLA-10401、SLA-20401和SLA-30401，肽段长度选择9aa，其他参数为默认，Rank%值越低表示肽段亲和力越强，综合结果得到T细胞抗原表位区域。综合蛋白二级结构易形成抗原表位区域和B、T细胞抗原表位分析结果，筛选出优势B、T细胞抗原表位。

1.2.5  基于HLJ/2018株非洲猪瘟病

毒pp220蛋白的进化树构建通过NCBIBlastP程序获取序列。使用ClustalX1.83对选取的序列进行比对。使用MEGA5.05（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）绘制进化树，Bootstrap设置为1000次，选择泊松模型验证。

2  分析结果

2.1  pp220理化性质

根据ProtParam分析结果，pp220蛋白共2476aa，分子质量为28.121905kDa，其中亮氨酸（10.7%）、天冬氨酸（7.7%）、谷氨酸（6.6%）的占比最高，其他的组分氨基酸占比为0.3%~6.3%不等。理论等电点为6.13，总共有39724个原子组成。带负电荷的氨基酸（酸性）总数为282，带正电荷的氨基酸（碱性）总数为262。预测280nm消光系数为235050~235550M-1cm-1之间（取决于半胱氨酸形成胱氨酸的程度）。在哺乳动物体外网状细胞中的半衰期为30h，在酵母中的半衰期大于20h，在大肠杆菌中半衰期大于10h。不稳定指数为43.30。脂肪族氨基酸指数为97.02，总平均亲水性为-0.296，属于亲水稳定蛋白。

2.2  蛋白跨膜区和信号肽分析结果

经分析，pp220蛋白不存在跨膜区（图1），信号肽分析结果的可能性为0.0021，即不存在信号肽（图2）。

2.3  蛋白抗原指数、亲水性、表面

可及性、滴定曲线分析结果抗原指数、亲水性、表面可及性分析结果见图3，由图3可见pp220蛋白抗原指数分布较宽，区域相对集中、连续，并且大部分区域显示为亲水区域，疏水氨基酸占比35.54%，这与ProtParam蛋白理化性质分析结果一致。蛋白表面可及性分析结果显示，露出表面的序列位置主要集中在4-14、27-34、44-49、84-89、96-106、113-116、204-207、223-230、245-256、308-327、350-358、366-387、394-408、454-463、476-487、504-513、549-554、561-576、591-600、632-640、681-686、740-745、824-829、845-850、874-881、925-928、962-967、984-992、1011-1017、1023-1027、1034-1037、1043-1050、1062-1071、1088-1092、1098-1103、1106-1113、1131-1138、1184-1188、1205-1209、1250-1255、1261-1267、1288-1294、1298-1303、1326-1331、1352-1355、1371-1379、1392-1400、1420-1429、1437-1442、1449-1461、1473-1478、1498-1509、1517-1520、1527-1536、1539-1544、1560-1567、1592-1600、1606-1611、1626-1635、1649-1656、1705-1709、1741-1745、1795-1803、1815-1824、1868-1871、1878-1888、1911-1914、1924-1928、1943-1948、1957-1963、1973-1988、2014-2020、2034-2047、2054-2065、2108-2113、2127-2136、2145-2151、2182-2186、2195-2206、2213-2220、2230-2237、2281-2291、2326-2335、2359-2366、2373-2381、2394-2397、2402-2410、2431-2435、2460-2471，共89个区域。蛋白滴定曲线分析结果见图4。

2.4  pp220优势B细胞抗原表位分析结果

综合蛋白二级结构分析结果及B细胞表位分析结果，选取二级结构分析结果中去除α-螺旋、β-折叠、β-转角等不易形成抗原表位的区域之外与B细胞抗原表位分析结果重合区域的肽段，作为备选的优势抗原，通过整合结果，得到53条优势B细胞抗原序列，详见表1。

2.5  pp220优势T细胞抗原表位分析结果

综合蛋白二级结构分析结果及T细胞表位分析结果，选取二级结构分析结果中去除α-螺旋、β-折叠、β-转角等不易形成抗原表位的区域之外与T细胞抗原表位分析结果重合区域的肽段，作为备选的优势抗原，再筛选强亲和力（strong binding，SB）的肽段，得到23条优势 T 细胞抗原序列，详见表2。

2.6  基于HLJ/2018株非洲猪瘟病毒

pp220的进化关系分析结果通过NCBIBlastP程序搜索pp220蛋白序列，选取与pp220蛋白长度相近的猪源非洲猪瘟病毒pp220蛋白序列作为分析序列，筛选出其余14条序列进行进化关系分析。结果显示，HLJ株pp220蛋白与格鲁吉亚2007/1、2008/1株同属一个分支，为基因Ⅱ型。从进化树上也可以看出，赞比亚主要流行基因Ⅰ型，肯尼亚流行IX、X型，并且乌干达2015年分离的病毒也属基因IX型，刚果2019年分离的病毒属于基因X型。

3  讨论

CP2475L基因是非洲猪瘟病毒基因组中的一个大基因，其编码pp220多聚蛋白前体，共含有2476个氨基酸，pp220蛋白前体经酶解后加工形成病毒主要的结构蛋白p150、p37、p34和p14，对病毒的组装成熟有重要作用。

文章通过生物信息学手段分析了CP2475L基因编码蛋白pp220的基础信息，结果表明pp220为带负电的酸性亲水稳定蛋白，抗原指数分布较宽，不存在跨膜区和信号肽。AndresG.等的研究推测pp220可能作为一个蛋白支架作用，连接核衣壳和外部包膜，但生物信息学分析结果表明pp220蛋白不存在跨膜区和信号肽，由此推测pp220可能更多地作为蛋白支架作用，维持病毒粒子完整，而CP2475L基因的抑制表达导致的病毒DNA的部分缺失可能是由于pp220蛋白经酶解加工后的产物与其他基因的编码蛋白相互作用导致的。

文章分别通过两种分析方法pp220蛋白二级结构和B、T细胞抗原表位进行综合分析，避免了单种分析方法的缺陷和不准确性，经过筛选，pp220蛋白有53条优势的B细胞抗原表位序列，并筛选到了23条强结合的优势T细胞抗原表位区域。优势T细胞抗原表位区域相对较少，由此推测单独通过pp220构建表位疫苗能够激发机体产生高水平的抗体，但是通过细胞免疫杀死病毒的能力相对较弱。通过Protean模块分析的蛋白表面可及性表明，蛋白有89个区域有连续暴露在外的氨基酸序列，与筛选出来的优势B、T细胞抗原表位结果一致，这些区域可作为靶向药物、表位疫苗筛选的对象。

基于HLJ/2018株非洲猪瘟病毒pp220蛋白构建的进化树显示，HLJ株与格鲁吉亚流行株同属一个分支，均为基因Ⅱ型，目前报道的非洲猪瘟病毒至少有24个基因型，欧洲主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型，亚洲流行主要基因Ⅱ型。但中国农业科学院哈尔滨兽医研究所对2020年国内采集的样品分析结果显示，中国已经有自然变异的毒株出现，分离到的22株病毒均有不同程度的变异，包括核苷酸突变、缺失、插入或短片段替换等，其中11株病毒存在核苷酸突变或缺失：HLJ/HRB1/20病毒在EP402R基因的第43-67位缺失25个核苷酸；9株病毒存在G131A突变；3株湖北分离株还存在G178A和G242A突变；HeB/Q3/20存在C301T突变，变异毒株表现趋势为低致死率、低毒力，临床症状进一步弱化，水平传播能力增强，这对我国非洲猪瘟的防控是一个巨大的挑战。

文章对HLJ/2018猪非洲猪瘟病毒pp220蛋白进行了一系列的基础生物信息学分析，分析结果进一步充实了非洲猪瘟病毒的基础研究数据，以期能够为非洲猪瘟的防控提供基础信息和方向。

本文选自《猪业科学》2021年第7期“猪群保健”栏目：P100-105（版权归《猪业科学》所有，如转载，请注明出处）。阅读更多内容可见网站：http://www.csis.cn。