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这篇配方是我原发在这儿的怕帖子沉了,搜索了一下就开了一个新主题。 另有Tricine SDS-PAGE凝胶配方(10%)的配方,有战友需要话我再发出来 。希望用了这个配方的战友如果效果好的话请跟贴说明,效果不好的话,我尽可能帮助战友们分析一下问题,反正这是我实践过的东西,不应该跑步出来的呀^_^另外Tricine SDS-PAGE16.5%是我见过最浓的Tricine SDS-PAGE的胶了,真没听说过20%Tricine SDS-PAGE胶,如果谁有说一下效果怎么样,是否能分离到几百,甚至几十分子量的肽? 16.5%Tricine SDS-PAGE胶的分辨率要比20%SDS-PAGE胶效果好,原因就在Tricine多了2个羟基,增加了与多肽的结合能力,这样在染色和脱色的时候多肽能牢固的结合在胶上,而不易被洗脱下来。 真是抱歉,到今天为止我才学会怎么看我以前留过言得帖子,配方我这有,是根据一篇外文译出来的,原文不知道放哪去了,这个配方对分离分子量10 000到1000的多肽类效果非常好,由于我得图谱需要写论文暂时不能上传参考图,反正好不好用大家试试就知道了,迟到了半年对不起於敏 战友,也许於敏 战友是用不上了,但后来的战友也许能用上,我也欣慰啦^_^ 一、Tricine SDS-PAGE药品配方如下 1.正极电泳缓冲液(1x): 12.19gTris 先溶于400ml双蒸水1mol/L的HCL调至PH8.9,再定容至500ml。 2.负极电泳缓冲液(1x): 6.055g Tris ,8.958g Tricine(三羟甲基甘氨酸),5.0g SDS ,将这三种药品溶于400ml双蒸水中,1mol/L的HCL滴定到PH8.45(这步大家注意了,我实际试验操作发现没调PH值前,PH值实际为8.35,因此用的是NaOH,老外的文章也不可信哦),在加水定容到500ml。 3.丙稀酰胺母液(49.5%T,6%C)Acrylamide 23.5g , bis 1.5g 加50ml水 4.凝胶缓冲液液(3X): 18.15g Tris,0.15gSDS,溶于40ml水中,用1mol/L的HCL滴定至PH8.45再加水至50ml。 以上溶液均需millipore膜过滤。(millipore膜过滤,具体用多大规格的老外没说,我开始用的是0.25ul的,在后来重新配制的也都没过滤(忘了),感觉效果差不多,请战友自己在试验中感觉吧^_^) 5.100%甘油 6.样品缓冲液1ml甘油(100%),0.5ml巯基乙醇,1ml 0.5mol/L Tris-HCL(PH6.8,6.05gTris-HCL溶于100ml水中),溴芬兰痕量(0.005%~0.02%),加水至5ml水中,分装成1ml大小,-20摄氏度保存。 二、Tricine SDS-PAGE凝胶配方(16.5%) 30ml体系(小板胶10ml到15ml即可,spacer为0.5mm-0.75mm): 丙稀酰胺母液 (49.5%T,6%C) 10ml 凝胶缓冲液液(3X) 10ml 100%甘油 3.1ml 去离子水 6.9ml 以上溶液脱气10-15min(据我试验比较,不抽气和抽气好像差别不大,但对试验要求严格的战友还是最好做这步,个人经验,仅供参考) 10%AP(过硫酸胺) 100ul(新鲜配置,4度保存至多一个月 TEMED 20ul 以上溶液最好都在4度保存 三、电泳参数 四、固定液:冰乙酸:甲醇:水=50:100:350 固定40min染色液:冰乙酸:甲醇:水=225:225:50 考马斯亮兰1.25g/L 染色1h脱色液:冰乙酸:甲醇:水=50:225:225 脱色30min后观察着,直到你满意效果为止另外,附上几篇关于Tricine SDS-PAGE的文献,大家可以参考一下!同时望广大战友补充和修正,以期完善Tricine SDS-PAGE电泳系统。 |
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