Western Blot操作步骤和产品选择指南

Western Blot

操作步骤和产品选择指南

一、

Western blot 

实验步骤概述

二、

Western blot

具体实验步骤

三、

Western blot 

实验注意事项

四、

Western blot

关于内参抗体

一、

Western blot 

实验步骤概述

1. 

组织取材：组织块称重

2. 

利用液氮、研钵粉碎组织块

3. 

加入

RIPA

缓冲液

(

每克组织

3 ml RIPA)

，

PMSF(

每克组织

30μl

，

10 mg/ml PMSF)

，

进一步匀浆

(15,000

转

/

分

*1

分钟

)

维持

4

℃

4. 

加入

PMSF

，冰上孵育

30

分钟

5. 

移入离心管

4

℃

约

20,000 g(

约

15,000

转

)15

分钟

6. 

上清液为细胞裂解液可分装

-20

℃保存

7. 

进行

BCA 

蛋白定量或者

Bradford

比色法测定蛋白质浓度

8. 

取相同质量的细胞裂解液

(

体积

*

蛋白质浓度

)

，并加等体积的

2×

电泳加样缓冲液

9. 

沸水浴中

3

分钟

10. 

上样

11. 

电泳

(

浓缩胶

20mA

，分离胶

35mA) 

12. 

电转膜仪转膜

(100mA 40

分钟

) 

13. 

膜用超敏可逆蛋白膜染色，胶用考马斯亮蓝染色或者新型快速蛋白染色试剂盒

14. Westernblot 

试剂盒显色

15. 

分析比较记录

二、

Western

具体实验步骤

    Western

，也称

Western blot

、

Western blotting

、

Western

印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western

可以参考如下步骤进行操作。

1.

收集蛋白样品

(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细

胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒

进行抽提。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用

的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还

原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京艾德莱生物技术公司生产的

RIPA

细胞裂解液（货号：

PP12

）

，

配套

PMSF(100mM)

苯甲基磺酰氟

（货号：

PP27

）

，定量可以使用

BCA

蛋白定量试剂盒

（货号：

PP01

）

。

2.

电泳

(Electrophoresis) 

(1) SDS-PAGE

凝胶配制

    SDS-PAGE

凝胶可以参考一些文献资料进行配制，

也可以使用北京艾德莱生产的

EasyPAGE 

通用快速

蛋白凝胶制备系统（货号：

PP26

）

。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度

SDS-PAGE

的配方。

(2) 

样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的

SDS-PAGE

蛋白上样缓冲液。例如

2X

或

5X

的

SDS-PAGE

蛋白