微生物专题

微生物16S结题报告里面的分析内容非常丰富，包含各种复杂的分析方法、算法和统计学概念。本文根据已发表文献（16S或者16S+代谢组）中出现的次数，从中挑出以下7项常见分析内容进行重点解析，助您从冗长的结题报告中快速筛选出核心分析内容，用于文章撰写。

1. 相对丰度柱形图（用于查看优势物种类型和丰度）

根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus）上最大丰度排名前10 的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样本在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。

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门水平相对丰度柱形图（左图为样本，右图为组）

横坐标是样本名（组名）；纵坐标（RelativeAbundance）表示相对丰度；Others表示图中这 10个门之外的其他所有门的相对丰度之和

2. α多样性（用于分析样本内物种多样性）

α多样性用于分析样本内（Within-community）的微生物群落多样性，通过单样本的多样性分析（Alpha多样性）可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。在结题报告中，采用7种常用指数来度量α多样性：Observedspecies、Chao1和Ace反映样本中物种丰富度，但不考虑每个物种的均匀度（物种的占比情况）；Shannon、Simpson、goodscoverage和PDwhole tree即反映物种的丰富度也反映物种均匀度。

同时，α多样性指数箱型图，用于分析α多样性组间差异，可以直观的反映组内物种多样性的中位数、离散程度、最大值、最小值、异常值。通过T-test、wilcox、Tukey、Kruskal-Wallis检验（只有 2个分组时进行 T-test和 wilcox秩和检验，分组大于 2时进行 Tukey和 Kruskal-Wallis检验）分析组间物种多样性差异是否显著。以observed_species 和shannon指数为例，其组间差异分析的箱形图如下：

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observed_species和shannon指数组间差异箱形图

3. β多样性（用于分析样本间物种组成差异）

β多样性是度量不同样本间菌群组成的相似度大小的指标，即关注各样本间的菌群组成差异。只有当样本（组）间菌群组成存在差异，才有可能进一步探讨菌群与疾病（不同处理条件）的关系。在报告中，采用PCA、PCoA、NMDS三种分析方法来考察和区分样本间的菌群组成差异。

首先根据所有样本的物种注释结果和OTUs的丰度信息，将相同分类的OTUs 信息合并处理得到物种丰度信息表（ProfilingTable）。同时利用 OTUs之间的系统发生关系，进一步计算Unifrac 距离（UnweightedUnifrac）。Unifrac距离是一种利用各样本中微生物序列间的进化信息计算样本间距离，两个以上的样本，则得到一个距离矩阵。然后，利用OTUs 的丰度信息对Unifrac 距离（UnweightedUnifrac）进一步构建Weighted Unifrac 距离。最后，通过多变量统计学方法主成分分析（PCA，PrincipalComponent Analysis），主坐标分析（PCoA，PrincipalCo-ordinates Analysis），无度量多维标定法（NMDS，Non-MetricMulti-Dimensional Scaling），非加权组平均聚类分析（UPGMA，UnweightedPair-group Method with Arithmetic Means）分析以及Beta 多样性指数组间差异分析等方法，从中发现不同样本（组）间的差异。

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β多样性分析（PCA、PCoA、NMDS）

上图中每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的物种组成结构越相似，落构成差异越小。PCA/PCoA图中：横坐标表示主成分1，纵坐标表示主成分2，百分比表示主成分对样本差异的贡献值；NMDS图中：Stress小于0.2时，说明可以准确反映样本间的差异程度。由于每个项目的实验设计和样本菌群组成差异巨大，无法预先知道哪种β多样性分析方法是将样本间菌群差异区分开的最优方法。因此，在报告中提供了多种β多样性分析方法和图片，在撰写文章时，您只需从中选出最能解释生物学问题的图片展示在文章中即可。

4. Lefse分析（筛选Biomarker）

通过前面的分析找到有显著差异的两组之后，需要知道两组之间的差异是由哪些菌群引起的，即差异微生物的筛选，也是biomarker的筛选。LefSe分析（LDAEffectSize）是一种用于发现和解释高维度生物标识（基因、通路和分类单元）的分析工具，可以用于进行两个或多个分组的比较，它强调统计意义和生物相关性，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的Biomarker。

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左：LDA值分布柱形图；右：物种分类学分枝图

左图LDA值分布柱状图中展示了LDA Score 大于设定值（默认设置为4）的物种，即组间具有统计学差异的Biomarker。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小（即为LDAScore），柱状图的颜色代表各自的组别；右分支图中，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。着色原则：无显著差异的物种统一着色为黄色，差异物种Biomarker跟随组进行着色，红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，若图中某一组缺失，则表明此组中并无差异显著的物种，故此组缺失。图中英文字母表示的物种名称在右侧图例中进行展示

5. 随机森林分析（biomarker验证）

随机森林属于集成类型的机器学习算法，利用自助聚集（bootstrapaggregating）重抽样方法从原始样本中有放回的抽取多个样本作为训练集，对训练集进行决策树建模，然后组合多个决策树的预测，通过投票得出最终预测结果。

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变量重要性排序图

左图MeanDecreaseAccuracy衡量把一个变量的取值变为随机数，随机森林预测准确性的降低程度。该值越大表示该变量的重要性越大。横坐标：平均下降准确度,纵坐标：排名前50重要物种；右图MeanDecreaseGini通过基尼（Gini）指数计算每个变量对分类树每个节点上观测值的异质性的影响，从而比较变量 的重要性。该值越大表示该变量的重要性越大。横坐标：平均下降Gini指数，纵坐标：排名前50重要物种。

根据随机森林方法筛选出的最佳模型，绘制ROC曲线，ROC是一种常用的统计学分析方法，在医学研究中主要用于评价诊断试验的效能。在报告中，通过绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积（AUC），来确定哪种菌（群）具有最佳的诊断价值。

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ROC曲线

横坐标：假阳性(Specificity)比例,纵坐标：真阳性(Sensitivity)比例，ROC曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。若AUC值为1.0，反映出对两个群组的完美区分，且不存在预测误差。若AUC值在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低准确性，AUC在0.7~0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC大爆发！平均IF>10 | 项目文章（大湾区）遍地开花

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