Nature：新冠病毒自然进化 不可能是人为制造

·这篇论文刊登在自然杂志上，通过比较已知冠状病毒株的基因组序列数据，可以确定新冠病毒起源于自然过程，并非人为制造

·起源方式有两种，一是病毒通过自然选择在非人类宿主中进化到目前的致病状态，然后跳到人类身上；在另一种设想中，病毒的非致病性版本从动物宿主跳到人类，然后在人类中进化到目前的致病性状态

此前的的研究确定了，SARS-CoV-2基因组的两个显著的“异常”特征突变，这也是外界病毒人工合成论的两个支点：1. 根据结构模型和早期生化实验，SARS-CoV -2似乎被优化以结合人类ACE2受体。 2.SARS-CoV-2的高度可变的刺突 S 蛋白通过插入12个核苷酸在 S1和 S2边界处带出一个多碱基裂解位点。这导致在多碱基裂解位点周围获得 O-连接聚糖。

研究表明：1. 决定病毒与 ACE2结合最重要的部分，是 RBD （受体结合结构域）的6个氨基酸残基。在所有六个 S1上关键 RBD 残基上，来自马来西亚的穿山甲完全与 SARS-CoV-2病毒匹配。如果人为根据 ACE2受体结合的几个关键残基，通过计算生物学进行人工设计的话，该点位上的氨基酸并非是最优选择。同样的，其它关键点位上预测的最佳氨基酸残基也不是最优解。因此，这更像是自然选择的结果。 2.SARS-CoV-2可能在细胞培养的传代过程中获得 RBD 突变位点。关于多碱基裂解位点的研究显示，在低致病性禽流感病毒在细胞培养或动物中长时间传代后，也观察到新的多碱基裂解位点。但O-连接聚糖的获得（如果是功能性的）否定了前两点的可能性：O-连接聚糖的产生通常意味着免疫系统的参与，而这种免疫系统在体外细胞培养环境下是不存在的。

自中国湖北省武汉市首次报道新型肺炎（COVID-19）以来，关于致病性病毒SARS-CoV-23（也称为HCoV-19）的起源产生了大量讨论。 SARS-CoV-2的感染现已广泛传播，截至2020年3月11日，在110多个国家中已确诊121,564例，死亡4,373例。

SARS-CoV-2是已知可感染人类的第七种冠状病毒。 SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2可以引起严重疾病，而HKU1，NL63，OC43和229E与轻度症状相关。 在这里，我们回顾了基因组数据的比较分析，可以推断出SARS-CoV-2的起源。 我们提供了有关SARS-CoV-2基因组显着特征的观点，并讨论了可能出现的情况。 我们的分析清楚地表明，SARS-CoV-2不是实验室构建物也不是有意操纵的病毒。

SARS-CoV-2基因组的显着特征

我们对α和β冠状病毒的比较确定了SARS-CoV-2的两个显着基因组特征：（i）根据结构研究和生化实验，SARS-CoV-2似乎针对性地与人受体ACE2结合； （ii）SARS-CoV-2的刺突蛋白在S1-S2边界插入12个核苷酸，从而有一个功能性的多碱基（弗林蛋白酶）分裂点位，这还导致了预计的3个O-连接聚糖的捕获。

1. SARS-CoV-2受体结合结构域的突变

刺突蛋白中的受体结合结构域（RBD）是冠状病毒基因组中变化最大的部分。已显示六个RBD氨基酸对于与ACE2受体结合以及确定SARS-CoV样病毒的宿主范围至关重要。使用基于SARS-CoV的坐标，它们是Y442，L472，N479，D480，T487和Y4911，它们对应于SARS-CoV-2中的L455，F486，Q493，S494，N501和Y505。这六个残基中的五个在SARS-CoV-2和SARS-CoV之间有所不同（图1a）。根据结构研究和生化实验，SARS-CoV-2的RBD似乎与人，雪貂，猫以及其他具有高受体同源性的物种的ACE2具有高亲和力结合。

图1a，SARS-CoV-2刺突蛋白的接触残基中的突变。 SARS-CoV-2的刺突蛋白（顶部的红色横条）与最相关的SARS-CoV样冠状病毒和SARS-CoV自身比对。 与ACE2受体接触的刺突蛋白中的关键残基在SARS-CoV-2和相关病毒中都用蓝框标记，包括SARS-CoV（Urbani株）。 b，获得多碱基裂解位点和O-连接聚糖。 多碱基裂解位点和三个相邻的预测的O-连接的聚糖都是SARS-CoV-2特有的，以前在谱系B beta冠状病毒中没有见过。 显示的序列来自NCBI GenBank，登录号为MN908947，MN996532，AY278741，KY417146和MK211376。 穿山甲冠状病毒序列是由SRR10168377和SRR10168378（NCBI BioProject PRJNA573298）产生的共有序列。

尽管以上分析表明SARS-CoV-2可能以高亲和力结合人ACE2，但计算分析预测相互作用并不理想，并且RBD序列不同于SARS-CoV中显示的对于受体结合最佳的序列。因此，SARS-CoV-2刺突蛋白与人ACE2的高亲和力结合很可能是在人或类似人的ACE2上自然选择的结果，它允许出现另一种最佳结合方式。这有力的证据表明，SARS-CoV-2不是故意操纵的产物。

2.多碱基弗林蛋白酶切割位点和O-连接聚糖

SARS-CoV-2的第二个显着特征是在S1和S2这两个刺突亚单位的交界处，有一个多碱基切割位点（RRAR）（图1b）。这可以通过弗林蛋白酶和其他蛋白酶有效切割，并在确定病毒感染性和宿主范围方面发挥作用。此外，在SARS-CoV-2的该位点中还插入了脯氨酸。因此，插入的序列是PRRA（图1b）。脯氨酸产生的转弯预计会导致在S673，T678和S686上添加O-连接的聚糖，它们位于切割位点的侧面，是SARS-CoV-2特有的（图1b）。在相关的B β冠状病毒中未观察到多碱基切割位点，尽管包括HKU1（A族）在内的其他人类β冠状病毒也具有这些位点，并预测有O-连接的聚糖。考虑到尖峰的遗传变异水平，很可能会在其他物种中发现具有部分或全部多碱基切割位点的SARS-CoV-2样病毒。

SARS-CoV-2中多碱基切割位点的功能后果尚不清楚，因此，确定其对动物模型的可传播性和发病机制的影响将非常重要。 SARS-CoV的实验表明，在S1-S2连接处插入弗林蛋白酶切割位点可增强细胞间融合而不影响病毒的进入。此外，MERS-CoV刺突的有效裂解可使蝙蝠类MERS冠状病毒感染人细胞。在禽流感病毒中，高密度鸡种群中的快速复制和传播是由于血凝素（HA）蛋白获得了多碱基分裂位点，其功能类似于冠状病毒刺突蛋白。通过插入或重组获得HA中的多碱基分裂位点，可将低致病性禽流感病毒转化为高致病性形式。在细胞培养物中反复传代或通过动物实验后，也观察到HA捕获了多碱基分裂位点。

尚不清楚预测的O-连接聚糖的功能，但它们可能会形成“粘蛋白样结构域”，从而屏蔽SARS-CoV-2的刺突蛋白上的抗原表位或关键残基。几种病毒利用粘蛋白样结构域作为逃避免疫的聚糖。尽管O联糖基化的预测是可靠的，但仍需要进行实验研究以确定这些位点是否用于SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2起源的理论

SARS-CoV-2不可能通过实验室操作相关的SARS-CoV样冠状病毒而出现。如上所述，SARS-CoV-2的RBD已进行了优化，与先前预测的有效解决方案不同，从而得以与人ACE2结合。此外，如果已经进行了遗传操作，可能已经使用了可用于β冠状病毒的几种反向遗传系统之一。然而，遗传数据无可辩驳地表明，SARS-CoV-2并非源自任何先前使用的病毒主链。相反，我们提出了两种可以合理解释SARS-CoV-2起源的方案：（i）在人畜转移之前在动物宿主中进行自然选择； （ii）人畜转移后人类的自然选择。我们还讨论了传代过程中的选择是否会引起SARS-CoV-2的出现。

1.动物宿主在人畜共患病转移之前的自然选择

由于许多早期的COVID-19病例与武汉的华南市场有关，因此该位置可能存在动物源。鉴于SARS-CoV-2与蝙蝠SARS-CoV的冠状病毒相似，蝙蝠可能是其祖细胞的储存宿主。尽管从中菊头蝠取样的RaTG13与SARS-CoV-2总体上约96％相同，但其刺突在RBD中发散，这表明它可能无法有效结合人ACE2（图1a）。

非法进口到广东省的马来穿山甲（Manis javanica）含有类似于SARS-CoV-2的冠状病毒。尽管RaTG13蝙蝠病毒仍是整个基因组中最接近SARS-CoV-2的病毒，但一些穿山甲冠状病毒与RBD中的SARS-CoV-2显示出很强的相似性，包括所有六个关键RBD残基（图1）。这清楚地表明，为结合人类ACE2而优化的SARS-CoV-2刺突蛋白是自然选择的结果。

迄今为止采样的蝙蝠β冠状病毒和穿山甲β冠状病毒均不具有多碱基分裂位点。尽管没有发现足够相似的动物冠状病毒作为SARS-CoV-2的直接祖先，但是蝙蝠和其他物种中冠状病毒的多样性均没有大量采样。冠状病毒的S1-S2连接点附近可能发生突变，插入和缺失，这表明多碱基分裂位点可以通过自然进化过程产生。为了使前体病毒同时获得多碱基分裂位点和适合与人ACE2结合的刺突蛋白突变，动物宿主可能必须具有较高的种群密度（以允许自然选择有效地进行）和编码ACE2的与人类直系同源基因相似的基因。

2.人畜共患病转移后人类的自然选择

SARS-CoV-2的祖先有可能进入了人类，通过在未检测到的人类之间的传播过程中进行适应而获得了上述基因组特征。一旦获得这些适应措施，将能够使大流行爆发并产生足够大的病例群，从而触发检测大流行的监视系统。

到目前为止，所有测序的SARS-CoV-2基因组均具有上述基因组特征，因此，它们也均来自拥有它们的共同祖先。穿山甲中存在与SARS-CoV-2非常相似的RBD，这意味着我们可以推断出这也可能是跳到人类的病毒。这使得多碱基分割位点的插入可以发生在人与人之间的传播过程中。

根据目前的序列数据估算出SARS-CoV-2的最新共同祖先的时间，表明该病毒在2019年11月下旬至2019年12月上旬出现，与最早的回顾性确诊病例相吻合。因此，这种情况假设在最初的人畜共患病事件和获得多碱基分裂位点之间，存在一段无法识别的人类传播时期。如果以前发生过许多人畜共患事件，并在很长一段时间内产生了人与人之间的短链传播，则可能会产生足够的机会。对于MERS-CoV，本质上就是这种情况，所有人类病例都是病毒从单峰骆驼反复跳出，产生单一感染或短链传播，最终不适应持续传播的而结束。

对堆积的人类样本的研究可以提供是否已经发生这种秘密传播的信息。回顾性血清学研究也可以提供有益的信息，并且进行的一些此类研究表明，在中国某些地区存在低水平暴露于SARS-CoV样冠状病毒。然而，至关重要的是，这些研究无法区分暴露是否是由于先前感染SARS-CoV，SARS-CoV-2或其他SARS-CoV样冠状病毒引起的。应该进行进一步的血清学研究，以确定人类先前暴露于SARS-CoV-2的程度。

3.通过时的选择

在全世界的生物安全性2级实验室中，涉及蝙蝠SARS-CoV样冠状病毒在细胞培养和/或动物模型中传代的基础研究已经进行了多年，并且有文献记载了SARS-CoV实验室逃逸的实例。因此，我们必须检查实验室意外释放SARS-CoV-2的可能性。

从理论上讲，SARS-CoV-2有可能在适应细胞培养传代过程中获得RBD突变（图1a），正如在SARS-CoV研究中所观察到的。然而，从穿山甲中发现具有几乎相同的RBD的SARS-CoV样冠状病毒，为SARS-CoV-2如何通过重组或突变获得这些提供了更强有力和更简化的解释。

多碱基分裂位点和预测的O-连接聚糖的获得也反对基于培养的情况。仅在体外或体内低致病性禽流感病毒的长期传播后，才观察到新的多碱基切割位点。此外，通过细胞培养或动物传代假想产生SARS-CoV-2，将需要事先分离具有非常高遗传相似性的祖病毒，这尚未被描述。随后需要在具有ACE2受体的细胞培养物中或动物中重复传代多碱基切割位点，所述动物具有类似于人类的ACE2受体，但是这种工作以前没有被描述。最后，由于细胞培养传代，预测的O-连接聚糖的生成也不大可能发生，因为这种特征表明免疫系统的参与。

结论

在全球COVID-19公共卫生紧急情况中，有理由怀疑大流行病的起因是什么。对动物病毒如何越过物种边界来如此有效地感染人类，对其的详细了解将有助于预防未来的人畜共患病事件。例如，如果SARS-CoV-2已预先适应另一种动物，则存在将来再次发生的风险。相反，如果适应性过程发生在人类中，则即使发生了重复的人畜共患病转移，如果没有相同的一系列突变，它们也不可能有效果。此外，鉴定在动物中传播的SARS-CoV-2的最亲近的病毒亲属将极大地有助于病毒功能的研究。确实，RaTG13蝙蝠序列的可用性帮助揭示了关键的RBD突变和多碱基切割位点。

这里描述的基因组特征可以部分解释SARS-CoV-2在人类中的传染性和传播性。尽管有证据表明SARS-CoV-2不是故意操纵的病毒，但目前尚无法证明或反驳此处描述的其起源的其他理论。但是，由于我们在自然界中相关的冠状病毒中，观察到了所有值得注意的SARS-CoV-2特征，包括优化的RBD和多碱基切割位点，因此我们认为任何类型的基于实验室的情况都是不合理的。

更多的科学数据可能使证据的平衡偏向于一种假设胜过另一种假设。从动物来源获得相关的病毒序列将是揭示病毒起源的最确定的方法。例如，将来观察到来自动物的SARS-CoV-2类病毒中的中间或完全形成的多价切割位点将为自然选择假说提供进一步的支持。获得有关SARS-CoV-2的更多遗传和功能数据，包括动物研究，也将有所帮助。同样，对SARS-CoV-2潜在中间宿主的鉴定以及对非常早期病例的病毒测序也将具有很高的信息意义。无论通过自然选择引发SARS-CoV-2的确切机制是什么，对人类和其他动物进行肺炎的持续监测显然至关重要。

中文标题： SARS-CoV-2的近端起源

通讯作者：Kristian Andersen，斯克里普斯研究所

发布日期：2020年3月18日

发布渠道：nature

原文地址：https://www.nature.com/articles/s41591-020-0820-9?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_content=organic&utm_campaign=NGMT_USG_JC01_GL_NRJournals#Sec1

原文标题：The proximal origin of SARS-CoV-2