经验分享：RNA m6A修饰与免疫功能调控研究进展

1.2 m6A擦除器/去甲基化酶

去甲基化酶的发现证明了m6A修饰是一种动态可逆的RNA修饰，开启了m6A修饰的研究热潮。fat mass and obesity-associated protein（FTO）和AlkB homolog 5（ALKBH5）是目前已经发现的两种主要的去甲基化酶（图1）。两者均含有AlkB结构域，包括两个激活位点基序：HXDXnH和RXXXXXR (X代表任意一种氨基酸）。HXDXnH基序可以结合Fe2+，RXXXXXR基序则能与α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）和RNA底物结合。FTO和ALKBH5在Fe2+和α-酮戊二酸的辅助下催化去除m6A修饰，FTO可能同时具有催化m6A和m6Am（N6,2-O-dimethyladenosine）修饰去甲基化的功能，而ALKBH5特异性催化m6A修饰的去除。此外，近年有报道黄素单核苷酸可作为新型人造去甲基化酶，不过区别于FTO和ALKBH5的酶催化途径，黄素单核苷酸以一种光化学的途径实现m6A修饰的去除。

1.3 m6A阅读器

m6A修饰通过招募m6A修饰位点结合蛋白可能是其行使功能的机制之一。目前报道的m6A阅读器蛋白包括YT521-B homology（YTHs）、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein（hnRNPs）和insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins（IGF2BPs）三大类蛋白家族（图2）。

图 2 m6A阅读器功能

YTH蛋白家族包括YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3（YTHDF1-3）和 YTH domain containing 1‒2（YTHDC1‒2），均含有YTH结构域。YTH结构域通过其内的色氨酸残基形成的金字塔形笼状三维结构识别m6A修饰，通过在细胞内不同区域表达的YTH蛋白家族，实现不同的功能。YTHDC1广泛表达，主要定位于细胞核，主要功能包括促进mRNA的剪切、表观基因沉默和核质运输；YTHDC2在特定的组织（如睾丸）内表达，在细胞核和细胞质均有分布，主要功能为促进mRNA的翻译和降解。YTHDF1‒3主要分布于细胞质，YTHDF1与转录起始因子如eIF-3作用从而促进含有m6A修饰mRNA的翻译；YTHDF2通过招募脱腺苷酸化酶复合物CCR4-NOT介导RNA降解；YTHDF3通过分别与YTHDF1和YTHDF2的相互作用，具有促进mRNA翻译和降解的两方面功能。

YTHs蛋白家族是目前发现明确可以直接识别并结合m6A修饰的阅读器蛋白，而其他一些存在RNA结合结构域的蛋白也有被报道作为m6A的阅读器蛋白，但仍然存在争议。hnRNPs蛋白家族，包括HNRNPC、HNRNPG和HNRNPA2B1，具有RNA recognition motif（RRM）结构域，参与可变剪切和转录本加工的调控。m6A甲基化可引起RNA底物局部结构的变化，使特定基序暴露，影响HNRNPC和HNRNPG对底物的结合强度，从而改变底物RNA的可变剪切，称之为m6A结构转换；HNRNPA2B1通过招募DGCR8复合物促进miRNA成熟。IGF2BPs蛋白家族，具有K Homology（KH）和arginine/glycine-Rich（RGG）结构域，包括IGF2BP1-3，正常情况下可招募RNA稳定蛋白如ELAV like RNA binding protein 1（ELAVL1）和matrin 3（MATR3），在促进mRNA的稳定性上具有重要的作用；应激状态下通过将RNA转入应激颗粒中促进其表达。fragile X mental-retardation protein（FMR1）蛋白也含有RGG结构域，通过阻碍核糖体转位抑制翻译；亦有报道FMR1与含有m6A修饰的mRNA发生结合时，能够促进FMR1蛋白的相分离，进而在体内诱导FMR1颗粒的组装形成，完成母源mRNA的降解。

2.1 m6A与树突状细胞

树突状细胞（DC）是经典固有免疫细胞的一种，同时也是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，是连接固有免疫应答和适应性免疫应答的“桥梁”。DC最重要的功能是加工和提呈抗原，启动适应性免疫应答。相较于无m6A修饰的RNA，当用含有m6A修饰的RNA去刺激DC时，DC会显著地表达更多的活化因子和活化标志物，说明m6A修饰在DC的活化中具有重要的作用。研究发现成熟DC的m6A修饰丰度和甲基转移酶表达（如METTL3、METTL14和WTAP）均高于未成熟DC，并且这些m6A修饰主要集中在NOD-like receptor（NLR）、tumor necrosis factor（TNF）和nuclear factor kappa B（NF-κB）通路，上述通路主要负责产生可以促进DC成熟的共刺激分子和促炎因子。YTHDF1可以识别这些含有m6A修饰的转录本，促进其翻译从而DC的活化和后续的T细胞应答。敲除METTL3可以抑制脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导的DC成熟，下调共刺激分子CD40和CD80以及其他炎症细胞因子，从而降低DC诱导T细胞免疫应答的能力。

除了经典的抗原递呈途径，DC还能以非经典途径提呈抗原，即MHC分子对抗原的交叉提呈途径，该方式对机体的抗肿瘤免疫应答十分关键。DC在摄取肿瘤相关抗原后，组织蛋白酶等酶类在吞噬小体中降解蛋白质、破坏抗原，从而限制抗原的交叉递呈。敲除YTHDF1可显著下调与吞噬体和溶酶体通路相关基因的翻译（如组织蛋白酶Cathepsin家族），从而延缓抗原降解，使得肿瘤浸润DC抗原交叉提呈更加高效。在黑色素瘤和结直肠肿瘤模型中，敲除YTHDF1的成熟DC可更高效地诱导T细胞活化，联合programmed cell death 1 ligand 1（PD-L1）阻断治疗，可更加有效地清除肿瘤细胞，证实了靶向m6A的固有免疫调控相关免疫治疗方案的可行性，或将会是提高肿瘤免疫治疗响应率的新思路。

m6A除了影响DC的活化，也参与DC迁移的调控。long non-coding RNA double PHD fingers 3（lnc-Dpf3）由C-C motif chemokine receptor 7（CCR7）诱导产生，可以结合hypoxia inducible factor 1 subunit alpha（HIF-1α），抑制糖酵解相关基因的HIF-1依赖转录，进而抑制依赖于CCR7的DC迁移。lnc-Dpf3上存在m6A修饰可被YTHDF2识别并促进其降解，促进DC的迁移，可能使得炎症反应加剧甚至破坏免疫稳态。

2.2 m6A与巨噬细胞

与树突状细胞类似，巨噬细胞的分化和功能也受到m6A修饰的调控。在局部微环境中，单核细胞由于病原体或不同类型细胞因子的刺激和诱导，可分化发育为两个巨噬细胞亚群：1型巨噬细胞（type 1 macrophage, M1）又称经典活化的巨噬细胞（classical activated macrophage），其主要作用为杀伤清除病原体和介导产生炎症反应；2型巨噬细胞（type 2 macrophage, M2）又称旁路活化的巨噬细胞（alternative activated macrophage），其主要作用为抑制炎症反应和参与损伤组织的修复和纤维化。诸多研究表明m6A修饰是调控巨噬细胞M1和（或）M2极化的重要因素（图3）。METTL3催化STAT1 mRNA上的m6A甲基化修饰使其稳定性提高，从而促进巨噬细胞向M1方向极化，抑制M2极化。

沉默FTO可以同时抑制M1和M2极化，其具体机制为STAT1 mRNA的稳定性降低抑制M1极化，STAT6和peroxisome proliferator activated receptor γ（PPARγ） mRNA的稳定性降低抑制M2极化。YTHDF2作为m6A修饰的阅读器蛋白，识别上述两种写入器和擦除器蛋白水平变化引起的m6A修饰水平变化；通过其介导的含有m6A修饰mRNA降解机制，调控巨噬细胞极化的关键基因mRNA稳定性，实现m6A修饰对巨噬细胞M1和（或）M2极化的调控。除了上述经典机制外，亦有报道IGF2BP2通过识别TSC1tuberous sclerosis 1（TSC1）的m6A修饰结合并稳定TSC1 mRNA调控其表达，TSC1可以结合并稳定TSC2，TSC1和TSC2形成复合物抑制MEK/ERK活性进而抑制M1巨噬细胞激活。另一方面STAT6结合high mobility group AT-Hook 2（HMGA2），促进IGF2BP2表达；IGF2BP2通过识别m6A位点结合并稳定PPARγ mRNA，介导巨噬细胞的脂代谢重编程，促进M2巨噬细胞激活。

图 3 m6A在巨噬细胞极化中的作用

m6A修饰除了参与巨噬细胞分化调控，在巨噬细胞生物学功能的实现中亦扮演着重要的角色（图4）。在巨噬细胞中特异性敲除METTL3可导致小鼠对沙门氏菌更加易感，肿瘤生长更快；进一步研究发现，TLR信号的负调控因子interleukin-1 receptor-associated kinase M（IRAKM）是METTL3的靶基因，敲除METTL3导致IRAKM mRNA上m6A修饰消失，降解变慢，导致IRAKM过表达，进而抑制TLR信号通路的活化及其下游炎症因子、共刺激分子表达，最终导致巨噬细胞抗感染及抗肿瘤免疫功能缺陷。

m6A甲基化酶METTL14在C1q+巨噬细胞中的丧失，导致巨噬细胞中Epstein-barr virus induced 3（Ebi3）转录本上m6A修饰的降低和EBI3表达量的增加，进而诱导肿瘤浸润的CD8+ T细胞的功能失调[45]。敲低YTHDF2可以稳定mitogen-activated protein kinase kinase 4（MAP2K4）和mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4（MAP4K4）的mRNA，激活mitogen-activated protein kinase（MAPK）和NF-κB信号通路，导致LPS刺激后RAW 264.7细胞中促炎细胞因子的表达增加和炎症反应的加重。

图 4 m6A对巨噬细胞激活及其效应功能的影响

3.1 m6A与T细胞稳态

T细胞的稳态对适应性免疫系统发挥正常功能至关重要。外周T细胞的数目通常维持相对稳定，以便T细胞迅速响应，识别并清除病原体，维持机体健康。T细胞稳态的调控来源于TCR对主要组织相容性复合体呈递自身肽段的识别，以及细胞因子如IL-7和IL-15等传递的信号。

在T细胞中特异性敲除METTL3（Mettl3fl/fl; Cd4-Cre）不影响T细胞在胸腺中的发育成熟，但外周T细胞的稳态被破坏。研究[48]发现，Mettl3fl/fl; Cd4-Cre小鼠外周的naïve T细胞所占的比例显著高于对照小鼠；将敲除METTL3的naïve CD4+T细胞（KO-CD4）过继转移至recombination-activating protein 2（Rag2）基因敲除的免疫缺陷小鼠(Rag2−/−)体内，几乎无法观察到KO-CD4细胞的稳态增殖及分化；敲除甲基转移酶复合体中的另一个核心组分METTL14后，得到一致的表型。上述研究证明m6A在维持初始T细胞的静息状态中具有重要的作用。

如前所述，IL-7在T细胞稳态的调控中不可或缺。KO-CD4过继转移至Rag2−/−小鼠体内后所呈现的表型与CD4+ T细胞过继转移至IL-7缺陷小鼠后所呈现的表型十分相似，此现象提示m6A修饰在T细胞稳态中的作用可能与IL-7相关通路相关。suppressor of cytokine signaling（Socs）基因家族可以有效结合包括IL-7在内的多种细胞因子受体，阻断STAT5及其下游通路的活化。当缺乏SOCS时，T细胞对IL-7信号高度敏感，而过表达SOCS则可以抑制IL-7信号。在KO-CD4细胞中，Socs基因〔Socs1、Socs3和cytokine inducible SH2 containing protein（Cish）〕的mRNA上存在m6A修饰，mRNA降解更慢和蛋白质表达水平更高。高表达的SOCS通过阻断IL-7/STAT5信号通路，抑制T细胞的稳态增殖。综上所述，m6A修饰可以通过调控Scos mRNA稳定性，协同IL-7相关通路，共同参与T细胞稳态的调控（图5）。

图 5 m6A对T细胞稳态及Treg功能的影响

3.2 m6A与调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)

Treg是重要的CD4+ T细胞亚群，参与免疫反应的负调控以避免免疫细胞过度活化导致的自身免疫相关疾病。核转录因子Forkhead Box P3（Foxp3）不仅是Treg的重要标志，也参与Treg的分化和功能。同时，Treg高表达IL-2受体，其介导的IL-2/STAT5信号通路是Treg发挥免疫抑制功能所必须的[52]。

通过Mettl3fl/fl; Foxp3-Cre小鼠在Treg细胞中特异性敲除METTL3后，小鼠会出现严重的自身免疫疾病，在出生后几周内死亡敲除小鼠可以产生正常数量的Foxp3+ Treg细胞，但是Treg细胞无法正常行使抑制性功能。体外共同培养METTL3敲除的naïve CD4+ T细胞和Treg细胞发现，naïve CD4+ T细胞由于缺乏Treg细胞的免疫抑制而呈现快速增殖状态。在Treg细胞中特异性敲除METTL3后，Socs基因家族的mRNA含量增加，从而抑制了IL-2/STAT5信号通路，导致了Treg细胞免疫抑制功能的丧失（图5）。

3.3 m6A与滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cell, Tfh）

Tfh参与生发中心的形成，在帮助B细胞产生高亲和力抗体和记忆B细胞形成中发挥关键作用从而促进体液免疫。研究发现，Tfh的分化成熟依赖m6A修饰，但具体效应仍然存在争议。有观点认为在CD4+T细胞中敲低METTL3或METTL14可以促进Tfh的发育。Von Hippel–Lindau （VHL）蛋白通过糖酵解-表观遗传的机制以m6A相关的方式调控ICOS的表达，影响Tfh的分化。VHL缺乏激活HIF-1α-GAPDH的糖酵解相关通路，促进METTL3的表达，使Icos mRNA上的m6A修饰增多，导致Icos mRNA降解，最终抑制Tfh的分化[55]（图6）。

但是有研究报道了相反的表型，在CD4+T细胞中条件性敲除METTL3会抑制Tfh的分化和增殖。敲除METTL3导致Tfh相关的标志性基因（Tcf7、Bcl6、 Icos及Cxcr5）表达显著下调，生发中心的形成受到抑制。转录组m6A修饰分析发现，Tcf7是METTL3的主要靶基因，METTL3缺失或Tcf7 3′UTR上m6A位点突变可加速Tcf7 mRNA的降解，影响Tfh分化重要调节基因如Bcl6、Icos等的表达，最终抑制了Tfh的分化（图6）。异位过表达TCF-1（由Tcf7基因编码）可挽救METTL3缺陷引起的Tfh的缺陷。

图 6 m6A对Tfh分化的影响

通过“写入器-擦除器-阅读器”构成的动态可逆调控网络，m6A修饰参与到免疫功能调控的方方面面。在固有免疫应答中，m6A修饰可以作为机体区分“自己”和“非己”的标志，也可以被病原体利用，成为逃脱宿主免疫识别的策略之一；m6A修饰还参与固有免疫细胞的发育成熟和功能调控，从表观转录组层面精细调节固有免疫反应。在适应性免疫应答中，m6A修饰对T细胞的稳态维持、Tfh的分化成熟和Treg的免疫抑制功能均具有重要的调控作用。正是由于m6A修饰在上述免疫调控中的重要作用，让靶向m6A成为病毒感染、肿瘤和自身免疫疾病中一个颇具前景的治疗靶点。在肿瘤免疫治疗领域，有诸多研究报道靶向m6A可以增强抗肿瘤免疫应答以及对免疫检查点PD-1/PD-L1抑制剂的响应，展现了靶向m6A与其他药物联用的潜在可能。

尽管在近十年内m6A研究领域有了跨越式的发展，但仍然存在许多挑战和局限。m6A修饰在同一个生物学过程中可能呈现截然相反的功能，目前的研究尚不能对其进行合理的解释；当前的研究仅仅针对调控网络中的一个节点进行研究，各节点之间的交互作用尚不明确；目前无法在单碱基水平明确具体每一个修饰位点的功能；m6A与其他RNA表观遗传修饰的关系仍不明确；m6A阅读器的研究相对匮乏，缺乏发现新的阅读器的方法；表观修饰包括DNA、RNA的修饰，蛋白质的转录后修饰，不同层面的表观遗传修饰之间的相互关系，效应的优先级差异等仍不明确。

m6A研究领域的突破性进展离不开方法学的进步，近期，m6A研究领域又有了新的关键方法学进展，或将再次推动m6A研究进入新的层面。已有课题组报道了一种单细胞m6A测序技术：single cell-deamination adjacent to RNA modification target sequencing（scDART-seq），此项技术将开启单细胞m6A测序的新时代。何川课题组报道了一种可以实现m6A定量的新方法：selective allyl chemical labeling and sequencing（m6A-SAC-Seq。该方法不依赖于抗体，可直接标记m6A，能够覆盖几乎所有的m6A经典基序，可以实现对微量RNA样本的m6A位点分析，在单碱基分辨率水平追踪m6A分布和含量的动态变化。

综上所述，m6A参与了免疫细胞的命运调控，具有重要的生物学功能，但仍有诸多关键机制不甚明了；突破技术瓶颈的关键方法学的出现，将m6A带入了单细胞和定量的新纪元，基于这些方法开展的研究，或许会颠覆此前对于m6A的认知，使表观遗传与免疫调控的故事更加精彩。

文献来源

张鹏, 赵文龙, 李金科, 等. RNA m6A修饰与免疫功能调控[J]. 四川大学学报（医学版）, 2022, 53(6): 1118-1126. 返回搜狐，查看更多