RNA 13. SCI 文章中差异表达基因之 WGCNA

    WGCNA 分析流程 2008 年发表在 BMC 之后的影响力还是很高的，先后在各大期刊都能看到，但是就其分析的过程来看，还是需要有一定 R 语言的基础才能完整的复现出来文章中的结果，这期就搞出来供大家参考，因为我自己尝试了一下结直肠癌的数据集，但是有些地方不太理想，故还是有软件包自带的数据来运行，终结起来就是输入两个文件，其他就是根据自己的数据集进行过滤，筛选，最终确定一个满意的基因集。

相关网络在生物信息学中的应用日益广泛。例如，加权基因共表达网络分析是一种描述微阵列样本间基因相关性模式的系统生物学方法。加权相关网络分析(Weighted correlation network analysis, WGCNA)可用于寻找高度相关基因的聚类(模块)，利用模块特征基因或模块内的中心基因来总结这些聚类，利用特征基因网络方法(eigengene network methodology,WGCNA)将模块之间和模块与外部样本性状进行关联，以及用于计算模块成员度量。相关网络促进了基于网络的基因筛选方法，可用于识别候选生物标记物或治疗靶点。这些方法已成功应用于各种生物学背景，如癌症、小鼠遗传学、酵母遗传学和脑成像数据分析。虽然相关网络方法的部分内容已在单独的出版物中进行了描述，但仍需要提供一种用户友好的、全面的、一致的软件实现和辅助工具。

WGCNA软件包是一个R函数的综合集合，用于进行加权相关网络分析的各个方面。该软件包包括网络构建、模块检测、基因选择、拓扑性质计算、数据仿真、可视化以及与外部软件的接口等功能。除了R包，我们还提供了R软件教程。虽然这些方法的开发是由基因表达数据驱动的，但底层的数据挖掘方法可以应用于各种不同的设置。

WGCNA软件包为加权相关网络分析提供了R函数，如基因表达数据的共表达网络分析。计算方法较为复杂，这里略去，我们根据文献中给出来的WGCNA方法概述一步一步进行实际操作。构建基因共表达网络：使用加权的表达相关性。识别基因集：基于加权相关性，进行层级聚类分析，并根据设定标准切分聚类结果，获得不同的基因模块，用聚类树的分枝和不同颜色表示。如果有表型信息，计算基因模块与表型的相关性，鉴定性状相关的模块。研究模型之间的关系，从系统层面查看不同模型的互作网络。从关键模型中选择感兴趣的驱动基因，或根据模型中已知基因的功能推测未知基因的功能。导出TOM矩阵，绘制相关性图。

WGCNA 分析流程如下：

1.构建基因共表达网络：使用加权的表达相关性；

2.识别基因集：基于加权相关性，进行层级聚类分析，并根据设定标准切分聚类结果，获得不同的基因模块，用聚类树的分枝和不同颜色表示；

3.如果有表型信息，计算基因模块与表型的相关性，鉴定性状相关的模块；

4.研究模型之间的关系，从系统层面查看不同模型的互作网络；

5.从关键模型中选择感兴趣的驱动基因，或根据模型中已知基因的功能推测未知基因的功能；

6.导出TOM矩阵，绘制相关性图。

WGCNA 整个流程的输入文件为 RNA-seq 测序结果计算获得的 Count 矩阵,通常我们需要转置输入数据，这样 rows = treatments and columns = gene probes，WGCNA 输出的是聚类基因列表和加权基因相关网络文件。WGCNA 数据过滤分析流程如下：

软件包安装及加载，如下：

第一步，读取表达数据，并进行预处理成适合于网络分析的格式，并通过删除明显的离群样本、基因和缺失条目过多的样本来过滤数据。表达式数据包含在R包中，文件名为 LiverFemale3600.csv。

Figure 1: Clustering dendrogram of samples based on their Euclidean distance.

添加表型信息，如下：

Figure 2: Clustering dendrogram of samples based on their Euclidean distance.

这一步是使用WGCNA方法进行的所有网络分析的基石。有三种不同的方式构建网络并识别模块，包括：a.采用第一步网络建设和模块检测功能，适合希望到达的用户以最小的努力获得结果; b.为想要尝试定制/替代方法的用户提供分步网络建设和模块检测; c.为希望分析数据的用户提供一种全数据块网络构建和模块检测自动检测方法集太大，无法集中分析。

首先选择软阈值能力，网络拓扑分析，如下：

Figure 3: Analysis of network topology for various soft-thresholding powers.

Figure 4: Clustering dendrogram of genes, with dissimilarity based on topological overlap.

Figure 5: Clustering dendrogram of genes, with dissimilarity based on topological overlap, together with assigned module colors.

Figure 6: Clustering dendrogram of genes, with dissimilarity based on topological overlap, together with assigned merged module colors and the original module colors.

Figure 7: Clustering dendrogram of genes, with dissimilarity based on topological overlap

将模块与外部临床特征相关联，如下：

Figure 8: Module-trait associations.

模内分析：鉴定高 GS 和 MM 基因

Figure 9: A scatterplot of Gene Significance (GS) for weight vs. Module Membership (MM) in the brown module

我们之前的分析已经确定了几个高度相关的模块（标记为 brown, red, and salmon）与重量。为了便于生物学解释，我们想知道基因的基因本体模块，它们是否在某些功能类别中显着丰富等。

GO 富集分析，如下：

可视化基因网络，对所有基因做图，如下：

Figure 10: Visualizing the gene network using a heatmap plot.

对所有基因进行筛选，在绘制热图，如下：

Figure 11: Visualizing the gene network using a heatmap plot

可视化特征基因网络，如下：

Figure 12: Visualization of the eigengene network representing the relationships among the modules and the clinical trait weight.

Figure 13: Visualization of the eigengene network representing the relationships among the modules and the clinical trait weight.

将网络数据导出到网络可视化软件中，有两种方式：  1.VisANT   2.Cytoscape 但是每种软件有自己的输入文件要求，根据代码生成就可以了，如下：   1. 输入到 VisANT 软件进行基因网络的互作绘图。