10.差异基因表达和分析的理论知识

一、基础知识

基因表达(gene expression)：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA中遗传信息(碱基顺序)经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是由相应的结构基因编码的。

差异基因表达(differential gene expression)：指细胞分化过程中，奢侈基因按一定顺序表达，表达的基因数约占基因总数的5％～10％。也就是说，某些特定奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞，这就是基因的差别表达。其本质是开放某些基因，关闭某些基因，导致细胞的分化。

                                                                                                                                                           ——百度百科

(通俗解释：有一群基因叫奢侈基因ABC，一般情况下只有A表达，A表达后生成的一种类型细胞发挥作用，但是现在B也出现表达，并且生成另一种类型的细胞，就产生了不同作用。而B就叫差异表达基因)

二、检测方法

检测基因表达的方法：转录水平(RNA)检测：RT-PCR，real-time PCR，northern blot翻译水平(蛋白)检测：western blot直接(基因)检测:报告基因、融合荧光蛋白等。

注意：RT-PCR是反转录PCR，是半定量方式；real-time PCR(定量即时聚合酶链锁反应)可以精确定量，简写为：Q-PCR/qPCR/rt-qPCR。

三、PCR的简单介绍

PCR:是利用DNA在体外95摄氏度高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物(PCR引物为DNA片段)与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链(就是这个酶把这些与单链结合的引物片段像拼图那样连接起来，形成一条新的DNA互补链)。

由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物(PCR引物为DNA片段)与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理(子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制)，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

实时荧光定量PCR技术:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

四、公共数据库中常见的测序技术

DNA Microarray(微阵列)：比较通俗的名字是基因芯片（gene chip），又称寡核苷酸阵列或杂交阵列分析。是DNA微阵列（micorarray）涂在特殊玻璃片上，然后在数平方厘米之面积上安装数千或数万个核酸探针进行测验，经由一次测验，即可提供大量基因序列信息。

1.DNA微阵列（DNA-microarray）:检测样本的基因组DNA，作为基因型别鉴定之检测。

2.cDNA 微阵列（cDNA-microarray）:或称expression array，将样本中的mRNA转为cDNA(在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链，又称互补或拷贝DNA)后进行检测，作为基因表达程度之检测与比较。

3.miRNA微阵列(miRNA-microarray) :检测miRNA相关的基因调控机制。

4.ChIP-chip:chromatin immunoprecipitation on chip芯片上的染色质免疫沉淀

5.高通量核酸定序芯片:合并特殊PCR反应及微阵列侦测技术转作为基因定序之用。

6.临床检测微管芯片:将低密度微阵列附于特制检验管底部，用以检测特定病原或癌症指标的试剂组。

7.CGH芯片:染色体芯片(array Comparative Genomic Hybridization，aCGH 或称Chromosomal Microarray Analysis，CMA)

8.SNP芯片:可检测基因多型性（Polymorphisms）。

9.基因甲基化芯片 :检测DNA被甲基化修饰程度。

RNA-seq:即转录组测序技术，就是用高通量测序技术进行测序分析，反映出mRNA,smallRNA,non-codingRNA等或者其中一些的表达水平。RNA-Seq可以应用于单细胞基因表达/蛋白质表达/RNA结构的分析；

即分为以下几步：

分离所有mRNA

逆转录mRNA成cDNA

对cDNA测序

比对参考基因组

流程：样品提取总RNA后，对于真核生物，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2000进行测序(这个流程了解一下就行)。

由上可见，两种方法测序结果是不一样的，所以最好不要混用数据。而PCR一般是用来验证。

五、两组测序数据的概率分布

microassay检测的是荧光信号的连续度量，相同基因在不同细胞的表达水平服从log-normal(对数正态)分布，由定量PCR验证。

RNA-Seq试验中，抽样得到的raw read counts服从泊松分布。

生物学上不同的样本间的差异服从负二项(negative binomial)分布,有时称gamma-Poisson分布。

了解数据分布类型，才知道正确的统计学检验方法。

六、差异分析的意义

1.在不同背景下比较mRNA水平

[if !supportLists]· [endif]同一物种，不同组织：研究基因在不同部分的表达情况

[if !supportLists]· [endif]同一物种，同一组织：研究基因在不同处理下，不同条件下的表达变化

[if !supportLists]· [endif]同一组织，不同物种：研究基因的进化关系

[if !supportLists]· [endif]时间序列实验：基因在不同时期的表达情况与发育的关系

2.基因分类： 找到细胞特异，疾病相关，处理相关的基因表达模式，用于诊断疾病和预测等

3.基因网络和通路： 基因在细胞活动中的功能，基因间的相互作用。

                                                                            ----摘自简书xuzhougeng《基因表达分析（上）- 差异表达分析》

七、差异分析工具的选择

如果是芯片数据，一般选择limma包。不过edgeR也可以。芯片数据默认符合正态分布，而limma正是基于正态分布的线性模型。

如果是二代测序如RNA-Seq测序的原始count值，一般选择DESeq或edgeR。注意这两者只能处理count，不能处理FPKM等矫正后的数据。二代测序数据符合柏松分布，理论上不能用T检验，只能用非参数检验（秩和），但是统计力度不够，所以还是得用经过矫正后的参数检验。

如果是FPKM等矫正后的表达量，可以用cuffdiff

总结: 基于以上，对于二代测序数据，先拿到原始count值进行DESeq2差异分析，再转换成TPM进行下游分析。不建议用edgeR和cuffdiff。

                                                                                                               ---摘自简书PriscillaBai《limma差异分析》