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来源：雪球App，作者： 行舟Drug，（https://xueqiu.com/4396147139/204303027）

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［摘要］近年来，按照药品研发并申报临床试验的细胞治疗产品大量涌现，其研发技术与评价体系处 于快速发展阶段。基因转导系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等病毒载体和转座子、TALEN、CRISPRCas9 等非病毒载体基因编辑系统等，广泛应用于不同种类细胞的改造。由于基因转导系统在细胞内表达、 组装、转导、基因整合的作用机制复杂，对其人体应用的科学评价构成了挑战。结合近期细胞治疗产品临床 试验申报资料审评和沟通交流过程中出现的问题，参考国内外相关技术指导原则，本文围绕基因转导系统中 慢病毒和转座子的设计和安全性评估，提出现阶段的药学审评考虑点，供研发者和监管方讨论交流。

［关键词］细胞治疗产品; 慢病毒载体; 复制型慢病毒; 转座子

［来源］Chinese Journal of New Drugs 2020，29( 1)

［作者］卢加琪，韦 薇，白 玉，罗建辉(国家药品监督管理局药品审评中心)

近年来肿瘤免疫疗法和再生医学产品的临床研 究不断深入，按照药品研发申报的细胞治疗产品逐 渐增多。国家药品监督管理局 2017 年发布《细胞治 疗产品研究与评价技术指导原则》以来，多个 CAR-T /TCR-T 细胞产品和干细胞/体细胞产品申报药品临床试验，涉及细胞类型多样，组织来源包括血液、 上皮组织、骨髓、脂肪组织、肌肉组织、眼球、脐带、胎 盘和牙髓等。由于细胞产品的功能需要，CAR-T /TCR-T 细胞 和部分成体干细胞及组织工程产品的制备过程中采 用了基因转导系统。理想的基因转导系统应能负载 一定大小的基因，高效进行基因递送，胞内表达时间 长，具有较低的免疫原性等特性。基因转导系统大 致可分为两类: ① 病毒载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。② 非病 毒的基因转导系统，包括质粒、mRNA 直接电转、转 座子、TALEN、CRISPR-Cas9 基因编辑技术等。在我 国申报的基因修饰细胞治疗产品中，病毒载体的应 用较为广泛。基因转导系统的设计和相应的风险控 制策略作为常见的议题，需监管方和研发者不断研 讨。结合相关的指导原则和研究进展，本文针对慢病毒载体和转座子，在结构设计、风险控制和安全性 评价方面提出监管方的考虑，供研发者参考。

1慢病毒载体的设计与评价

 慢病毒亚科是逆转录病毒科的亚科之一。根据 生物来源不同，慢病毒可分为人类免疫缺陷病毒( HIV)、猫免疫缺陷病毒( FIV) 和马传染性贫血病 毒( EIAV) 等类型。目前申报的细胞治疗产品多使 用 HIV-1 衍生的慢病毒载体。

 1.1基于HIV的慢病毒载体包装系统的设计

 HIV-1病毒是有包膜的RNA 病毒。在HIV-1的结构基因中,gag基因编码核心蛋白p18,p24,p7; pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶; env 基因编码病毒包 膜蛋白; 此外，HIV-1野生毒株含有2个调节基因tat和rev，用于调节病毒基因转录和翻译，以及 4个辅助基因vif，vpr，vpu，nef参与整合前复合物形成、病毒颗粒组装等; 病毒基因的两侧为长末端重复序列 LTＲ，LTR中含有顺式作用元件，其中3’LTR的U3区有3 个转录区，具有启动子活性和病毒复制能力。经过科学家的数次改造，目前已经衍生出多于三代的基于HIV-1结构的慢病毒包装系统［1］,见表 1。第 1 代慢病毒转导系统含有包装质粒和载体质粒2个质粒: 载体质粒包括顺式作用元件( LTR、包装信号 psi 等) 、目的基因; 包装质粒含有除顺式作 用元件外的 HIV-1基因结构，其中辅助基因仅去除了参与病毒颗粒组装的 vpu; 包装质粒中的 env 包膜基因常见由水疱性口炎病毒 G 糖蛋白( VSV-G) 基因代替，使该病毒不仅局限于感染 CD + 4 细胞，同时增强了病毒颗粒的稳定性便于后续纯化浓缩。第 2 代慢病毒转导系统多采用 3 个质粒，该系统进一步 去除了辅助基因 vif，vpr，nef，将VSV-G 包膜蛋白从包装质粒中分离出来，从而把 VSV-G，gag-pol-revtat，顺式作用元件-目的基因三者分离于不同质粒表 达，降低了同源序列重组的概率。第 3 代包装系统 去除了 tat 基因，降低了病毒基因的转录水平，同时 将 rev 和 gag-pol 分离于不同质粒表达，并通过密码 子优化进一步减少了序列重叠; 由于 tat 基因缺失，LTR上游需要引入较强的启动子确保一定的RNA转录水平，1999年，Iwakuma 等［2］发现将3’LTR的U3区删除，减弱了该区域增强子和启动子的活性，形成自失活型慢病毒载体( self-inactivating，SIN) ，在不影响病毒滴度的同时提高了载体的安全性。当前涉及使用慢病毒的细胞产品的临床研究中，大部分使用了自失活型慢病毒载体后期，通过包装系统的不断升级，也出现了将 gag 和 pol 基因分离表达的 6 质粒、7 质粒慢病毒包装系统( Lenti-X，Super-split 等［3］) 和使用 tet-on /tet-off 元件可诱导表达型慢病毒系统等，由于这些生产成本较高或涉及使用诱导剂，目前多见用于早期研 究，未见上市细胞治疗产品使用。综上，通过删除非 必需的基因、将病毒基因分散于不同质粒表达、减少 同源序列、抑制颗粒组装、自失活改造等措施，慢病 毒载体的临床使用安全性逐步提高。

1.2 慢病毒载体的人体应用和监管考虑 

 2003年，慢病毒改造的细胞产品第一次报道用于人体。该细胞为自体T细胞，使用非自失活二质粒系统制备的VRX496慢病毒进行改造，见表1。VRX496 病毒包装系统删去了所有辅助基因，rev与gag，pol均串联表达于同一质粒。由于慢病毒的安全性尚不明确，该临床试验的受试者仅为HIV感染人群［4］。临床试验开展前后，慢病毒载体、病毒生产终末期细胞、T 细胞终产品、回输后患者长期随访阶段均采用细胞培养法进了复制型慢病毒( replication-competent lentivirus，RCL) 的检测，均未检测到RCL阳性［5］。该临床试验期间也开展了宿主整合位点、插入突变等系统研究，未发现重大安全性风险。此后慢病毒载体介导的细胞和基因治疗临床研究进入了快速发展期。截至2019年6月，在clinical trials 官网可查询到4700余项涉及慢病毒载体的临床试验。近年开展的临床试验大部分使用了四质粒包装系统生产的慢病毒，使用早期慢病毒载体的临床研究目前多数已经完成，且受试者数量较少，未见CL检测等系统安全性评估［6］。国际监管方的考虑方面，美国 FDA 建议选择同 源重组及回复突变发生概率较低的包装系统，相关指导原则指出将包装用基因分离于不同质粒表达 ( gag /pol 和 rev 分离) ，删除病毒包装不必要的调控 元件( nef，tat 等) ，改构长末端重复序列使得末端自失活(SIN)，均可降低同源重组和可复制型病毒出现的概率［7］。欧盟EMA2019年发布的指导原则征求意见稿，在慢病毒包装系统设计和生产过程中，建议引入所有可能降低慢病毒致病风险的措施，其中包括不同基因应分离于不同质粒表达，降低辅助质粒和转移质粒间的序列同源性，降低与人体内源性病毒重组风险等［8］。综合慢病毒载体的临床应用经验和国际通行的监管指南，笔者认为，与第2代三质粒系统相比，第3代四质粒慢病毒包装系统进一步降低了慢病毒回复突变和同源重组的可能性。现阶段申请人若按照药品进行细胞治疗产品的研发，采用慢病毒进行基因递送或编辑时，鼓励使用安全性更高的第 3 代 4个或 4 个以上质粒系统包装慢病毒，同时建议使用含有末端自我失活结构、经充分改造的病毒载体。另外，应规范开展病毒、基因修饰细胞和患者用药后 的 ＲCL 检测。

1.3 可复制型慢病毒监测

 迄今，已应用于人体的慢病毒载体及相关细胞产品中尚未有检出RCL 的报道。理论上目前采用的病毒包装系统降低了RCL出现的可能性，但未能完全排除，因此各国监管机构仍把RCL作为重要的安全性风险关 注点［7-8］。目前的科学研究进展仍未清晰揭示RCL的病毒结构，有研究报道鼠白血病病毒的包装过程中曾检测出可复制型病毒，其含有病毒包装基因的序列和包装用细胞的基因序列［10］。根据RCL产生的机制,人们已经发现了多种可 能指示RCL的标志物。例如,包装质粒和转移质粒gag起始区域序列的同源性高，因而两质粒间可能重组产生RCL［11］; 另外，扩增得到的以 VSV-G 作为包膜蛋白的RCL，可能将 VSV-G 序列迁移至指示细胞的基因组中［12］; 复制型病毒具有逆转录酶活性，PERT( product-enhanced reverse transcriptase) 的检出也可指示RCL，但需要考虑到指示细胞自身表达逆转录酶的情况［13］。综上，当前一般认为 gag 基因编码的p24 蛋白及指示细胞中psi-gag和VSV-G 序列的检出可反映RCL的存在。对于临床级别的慢病毒载体，应建立具有较高灵敏度的RCL检测方法。常用的检测方法有细胞培养法和直接qPCR法。细胞培养法检测RCL时， 将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育，细胞传代 5 次以上，培养至少3周( 扩增期) 。3 周后收集培养上清，接种于 naive C8166 细胞中培养 7 d 后检测RCL 标志物( 指示期) 。由于RCL的结构未知，检测时选择何种毒株作为阳性对照具有挑战性。临床使用的慢病毒的包膜蛋白为 VSV-G，理论上使用以 VSV-G 包膜蛋 白的 HIV-1 毒株作为阳性对照，比使用减毒的野生 HIV毒株更合理［14］。Escarpe 等［15］报道，使用缺乏 辅助基因的 HIV 弱毒株可以作为RCL检测的阳性对照( 如 Ｒ8.71 病毒，其辅助基因中删去了 vpr，vif 和 nef，保留了 vpu，其TCID50值约为 10 ～ 20 fg 的 p24 蛋白) 。根据 FDA 指导原则，RCL检测的待测样品包括病毒生产过程中收获的病毒上清、生产终末细胞和经病毒转导后的细胞产品［7］。对 病 毒 上 清 进 行RCL 检测时，应考虑到高浓度的慢病毒对RCL检测 敏感细胞C8166 的生长具有显著抑制作用。例如 物理滴度为10000 ng·mL-1 ( p24 蛋白含量) 的慢病 毒孵育细胞 4 h 后，60 %细胞生长受到抑制，物理滴 度为1000ng·mL-1的慢病毒孵育后抑制10%的 C8166 细胞生长［16］。因此待测病毒样品滴度较高时，应进行稀释。FDA 相关指导原则要求在病毒上清中加入阳性对照，作为抑制组对照，在每一批病毒上清检测时同时检测。另外，应确保病毒RCL检测方法的灵敏度和检测样本量达到细胞产品临床使用 剂量的安全性需要。FDA 指导原则要求，假设患者的临床用剂量中含有1个RCL，对应的病毒上清的检测样本量应至少确保 95% 的检出可能性［7］。直接qPCＲ法通过ＲT-PCＲ扩增待测样品中RCL的标志性序列( psi-gag，VSV-G) 检测，不涉及RCL在细胞中的扩增过程，耗时较短，检测方法相对简便。该方法的缺点是，在体外包装的病毒载体中往往存在残余质粒DNA的污染导致假阳性结果， 此外，重组产生RCL的机制较为复杂，由于病毒包装系统多样，产生的RCL可能不具有PCR引物匹配的序列，因而假阴性结果也难以避免。细胞培养方法涉及RCL扩增的过程，方法更为灵敏，假阴性结果出现的概率低。该方法的缺点是耗时较长，对照设计复杂，且涉及使用阳性对照毒株，需要在较高级别的生物安全实验室进行，该方法的建立对很多研发者来说较难，但已有披露的研究资料可供参 考［15 -17］。因此笔者认为，检测病毒载体的RCL时，建议申请人根据所用慢病毒包装系统设计特异的检测标志物，同时鼓励申请人采取 2 种基于不同原理针对不同标志物的RCL 检测方法，从而提高RCL的检出率［18］。临床试验申报时，建议采用经初步验证的细胞培养法完成病毒( 上清液、生产终末期细 胞) 的RCL检测，验证过程应关注检测样本量和抑制组对照。对于病毒转导后的细胞，如果对于病毒上清液 等进行了比较全面合理的RCL检测，审评常见采取 qPCR法进行RCL的检测放行。FDA 指导原则草案规定，如果有充足的生产和临床应用经验说明使用该病毒制备的细胞持续RCL阴性，申请人可提供相应数据，申请减免基因修饰细胞的RCL检测［7］。在这种情况下，申请人应在与监管方沟通交流时，详细讨论病毒载体包装系统的安全性设计考虑，对其产生RCL的可能性进行充分评估，同时应递交按照现行指导原则规范完成的慢病毒载体RCL检测数据。因此笔者认为，对于细胞产品，可采用方法学验证后的快速方法进行RCL的检测放行，同时留样用指示细胞培养法进行回溯检测分析。此外，提请申请人在生产过程中对RCL 进行监控。

 2非病毒载体系统

不依赖于病毒载体进行目标基因转导的细胞治疗产品，可使用转座子系统电转导、质粒/mRNA电转导、TALEN、CＲISPＲ-CAS9 基因编辑等方法进行 基因递送。下面以转座子系统为例进行阐述。

      2.1 转座子系统及其人体应用 

      转座子系统与病毒载体相比，其携带基因较大(可达 100kb) ，基因转导过程快捷，质粒生产成本低，免疫原性低，缺点是转导效率相对较低，通常用电转导使得细胞大量死亡，且容易出现目的基因多个拷贝整合的情况［19］。常见的转座子系统有SB睡美人转座子 Sleeping Beauty，PB 转座子piggyBac 和Tol2等，应用于人体细胞改造的系统主要为SB睡美人转座子和PB转座子。转座子系统包括的元件有: 转座子(transposon) ，即两端含有反向重复序列 ( inverted terminal repeat，ITR) 的目的基因; 转座酶( transposase) ，该酶表达后可结合于转座子的ITR序列，切割转座DNA序列后形成发卡样结构，与待修饰细胞基因组的特定序列匹配后整合在基因组中(piggyBac系统靶向 TTAA 序列，Sleeping Beauty系统靶向TA序列) 。经 clinical trials 网站查询，利用睡美人系统生产的 CAR-T 细胞已在淋巴瘤患者中开展多个Ⅰ期临床试验(包括 NCT00968760 和NCT01497184)［20］，另外睡美人系统也已用于TCR-T细胞的制备，即将靶向新生抗原的T细胞受体基因整合至患者自身T细胞，从而进行实体瘤的治疗［21］。PB转座子系统也已用于人体临床试验，如针对多发性骨髓瘤的BCMA CAR-TⅠ期临床试验已取得了初步结果 ( NCT03288493)［22］。虽然目前SB睡美人系统的人体应用案例多于其余2个系统，近年来报道的SB系统过表达导致的转座抑制活性和在靶细胞中较高的整合拷贝数仍呈现出其人体应用的风险，建议研发者在早期临床研究时谨慎考虑其结构设计、用量和相应安全性评估等［23-24］。 

       2.2转座子系统的设计和安全性评价 

      近年来通 过对末端重复序列和转座酶的改造，人们已开发出 DNA 剪切活性和转座活性不同的转座系统，如睡美 人系统的SB11，SB32，SB100X以及piggyBac系统的mPB，hyPB［23］。有研究报道，SB 睡美人系统 SB100X 的转座活性显著高于Tol2，PB 系统的转座活性位于二者中间。在转座子质粒大剂量电转细胞后，3 种系统均可由于过表达导致转座活性的抑制。插入拷贝数方面，SB100X 系统在 HeLa 细胞中整合的拷贝数为每克隆2～40拷贝，拷贝数分布范围显著高于 PB( 每克隆1～3拷贝) 和Tol2 (每克隆1 ～4 拷贝)［24］。根据转座子系统的前期研究，安全性相关 的设计考虑主要在于转座酶、转座子序列的优化、转座酶/转座子DNA的比例、质粒个数以及转座酶在细胞内的表达时间等。不同的细胞类型中，同一转座子系统的活性也具有较大差异，例如转座子系统在人胚胎干细胞内的基因转导活性普遍较低。另外，转座子系统的DNA剪切活性和基因转移效率并不具有强相关性，在开发过程中应同时关注转导效 率、插入位点的个数、目的基因在靶细胞中整合的拷贝数等［25］。在对人体细胞进行基因转导时，建议针对特定细胞类型，对转座子序列和转座酶基因的比例进行研究，该比例影响着质粒骨架DNA的整合效率和基因漂移的概率。质粒个数方面，常见将转座子和转座酶序列分散于2个质粒表达，在质粒电转导时2个质粒需同时进入细胞才能成功进行基因编辑。据报道，将PB转座子序列和转座酶基因串联在同一质粒表达(‘cis’) ，可显著增加转座酶基因整合于 HEK293细胞的概率，同时转座酶在细胞内的持续表达时间可长达转导后31d，而两质粒系统 (‘trans’) 改造的目标细胞中转座酶基因整合率较低，最长可观察到转座酶7d的持续表达［26］。另外， 转座子介导的基因插入可能出现转录沉默的情况， 在转座子质粒设计时加入隔离元件( insulator element) 可有效阻止启动子和增强子的相互作用，从而增强目的基因的表达水平［27］。转座子系统在人T细胞基因组中的整合位点具有随机性，但是不同转座子系统的基因整合选择性有所不同［28］，需要针对具体结构设计进行安全性评价。例如，piggyBac系统更倾向于将目的基因插入转录起始位点，而Sleeping Beauty系统无明显整合倾向性［29］。根据转座子系统非定点整合的特点，转座子系统临床应用的风险包括: 质粒骨架DNA和转座酶基因在细胞基因组的插入、抑癌/癌基因中的插入、转座子在基因组中移动( genomic mobilization) 等。在细胞产品制备的过程中，建议申请人尽量删除质粒中不必要的序列，对关键的质量指标进行过 程控制，持续关注细胞产品中转座酶和质粒中其他 结构基因的残留情况，同时监控转座酶的持续表达 时间。鉴于转座子系统的基因毒性仍不明确，在基 因组中的插入位置、拷贝数等具有不确定性和较大变数，且不同转座子系统间、不同个体细胞间存在差异，必要时应在受试者给药后进行长期监测。 

      3 展望 

      伴随合成生物学和基因编辑技术的进步，围绕罕见病和重大难治疾病等展开的医学实践不断探索着新型细胞和基因治疗产品的疗效。1993—2019年间，世界上仅肿瘤细胞治疗临床研究就开展了1216项，至今仍有760余项正在研究中。多靶点CAＲ-T细胞、通用型CAR-T细胞、工程NK细胞、类器官和人工器官等新的治疗技术发展，对基因转导 系统的递送效率和安全性提出了更高的要求。在基础研究领域，通过整合酶、LTR的改构等策略，非整合型和定点整合型慢病毒载体也取得了进展［30］。更安全高效的CRISP-Cas9基因编辑系统、RNA编辑系统的研究也在持续，预期未来将收获更多的人用经验。生产方面，越来越多的病毒载体 CDMO 生产平台日趋成熟，为细胞产品研发企业提供了 GMP级别的基因递送载体。监管政策方面，各国药监局将细胞治疗产品按照先进治疗医学产品(ATMP) 、 再生医学先进疗法(RMAT) 等提供了较多加速审批路径，并出台了相关指导原则［31］。在我国，目前能够检测RCL/RCR的第三方机构缺乏，病毒载体生产平台也需要加强。相信通过研发者、第三方和监管方的共同努力，高安全性、低成本的基因转导系统将为复杂难治疾病的患者带来新的希望。 

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