PCR、qPCR、RT

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）是在体外酶促扩增特定DNA片段的技术，由美国Kary Mullis及其同事于1985年发明。热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化装置的发明与完善，使PCR技术进入实用阶段。该技术的发明和广泛应用，大大推动了分子生物学各相关学科的发展，发明者也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

随着PCR技术的成熟，派生了不少相关技术。这类技术具有敏感、特异、快速和简单等优势，在微生物检验中的应用越来越广，不少国家将其纳入检验的标准方法；我国检验检疫领域对其应用也日益扩大，国家要求市级以上疾病预防控制中心具有PCR检测技术能力，用于突发公共卫生事件的快速检测和食品安全的有效监管等。

PCR技术的基本原理和DNA在体内天然复制过程相似，是在体外重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新DNA链的过程，只是整个过程在体外进行，而且反应体系比体内更简单。

1．体系组成和基本过程

（1）体系组成经典PCR以DNA为模板，体系组成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合适的盐、缓冲液以及温度循环参数等。原始模板是指长的双链DNA待扩增目的片段，微生物检验中往往是待测标本中的DNA。引物是两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段的两端分别相同和互补。原料则是4种脱氧核苷三磷酸。

（2）基本过程PCR基本过程分为变性、退火和延伸三个阶段，经过多次循环实现目的片段的扩增。变性是指将反应体系混合物加热至93℃~95℃，维持较短的时间，一般30s，使待测的双链DNA在高温作用下变性，解链为2条单链DNA模板的过程。退火是指将反应体系混合物冷却至特定温度（也称退火温度）。延伸是指将反应体系的温度提高到72℃，在耐热DNA聚合酶作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为原料，按碱基配对原则，合成与两条模板DNA互补的2条新的DNA链。

2．PCR技术的特点PCR技术显著的特点，决定了其无论在生物学相关领域的研究，还是在微生物检验方面，都具有很重要的地位。

（1）高灵敏度：产物量以指数方式增加，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞等等。

（2）高特异性：以碱基配对原则使引物与模板DNA特异正确的结合、DNA聚合酶合成反应具有高度的忠实性、靶基因DNA具有高度特异性和保守性。

（3）方法简便和快速：一次性加好反应液，于DNA扩增仪进行变性-退火-延伸，2~4h完成扩增反应；而且扩增产物易分析、无放射性污染、易推广。特别是实时荧光定量PCR的发明和推广，可以通过电脑实时监控反应进程，不需要再对产物进行检测，大大缩短了实验时间。

（4）对样本的纯度要求低及适用范围广：PCR技术对样本的纯度要求低，DNA粗制品可作为扩增模板；不一定需要分离病毒、细菌或培养细胞；可直接用临床血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等样本的粗制DNA扩增检测。适用范围非常广泛，不仅适合于微生物的快速检测，还可用于临床和法医等各方面。