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二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

方法一：SYBR Green法

（一）工作原理

1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位

 2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光

4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:

 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 　　2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 　　3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物　　4、反应Buffer 体系的优化　　5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定　　 6、其他与常规PCR相同

（二）应用范围

1、起始模板的测定；　　2、 基因型的分析；　　3、 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

（三）优点及缺点

优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏； 便宜。

 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；   对引物特异性要求较高。