基于ADAR的活细胞RNA传感器

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撰文 | 望夜

RNA感知-响应系统是机体用于鉴别并摧毁有害细胞（如肿瘤和自身免疫异常的细胞）的机制，也可应用于复杂体系（如神经和免疫系统）中特定细胞的实验性操作。分子RNA传感器允许对不同背景下特定细胞类型和细胞状态进行研究和治疗干预。但现有的RNA感知技术仅限于小RNA（miRNA）【1】，需要设计特殊的功能性RNA结构，如核酶、向导RNA、或内部核糖体进入位点。但这些特定结构还需应对细胞对双链RNA（dsRNA）的天然免疫反应【2】。

有没有可能借助细胞的这种反应机制设计新型RNA传感器呢？2022年10月5日，斯坦福大学的Xiaojing J. Gao课题组在Nature Biotechnology杂志上发表了文章Modular, programmable RNA sensing using ADAR editing in living cells，巧妙利用细胞中dsRNA编辑的腺苷酸脱氨酶（RADAR）设计出一种模块化的可编程系统，用于活细胞中RNA的感知。该方法可用于人源和鼠源多种dsRNA形式的检测输出。通过对输出水平、动态范围的优化，该系统可拓展至多种不同的应用场景中。

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ADAR可结合于dsRNA某些区段上，将腺嘌呤A编辑为与鸟嘌呤G结构类似的次黄嘌呤I【3】。受近期基于ADAR的RNA编辑研究进展的启发【4】，作者利用对终止子UAG的编辑（变为UGG），实现相应的蛋白输出。该ADAR传感器由三部分组成：一段可选的marker编码序列，一段与目标RNA互补的传感器序列，同时在待编辑的UAG中引入一个增强编辑的C:A错配，及一段输出编码序列（CDS）。三段序列之间用自剪切的2A序列隔开【5】，以保证效应蛋白与传感区段“绝缘”。当传感器未被编辑时，由于UAG终止子的存在，仅前半部分的marker（如图1中的mCherry）可以表达；当目标RNA（trigger）出现时，传感器与trigger形成dsRNA，招募ADAR执行编辑活性，促使下游CDS表达（如图1中的EGFR）。

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图1 ADAR传感器（RADAR）工作示意图

Trigger区选定在3’非编码区（3’-UTR），这是由于ADAR对该区域的编辑效率高于CDS区【6】，且ADAR不太容易干扰trigger区编码的蛋白产物。大部分人源（57%）和鼠源（73%）基因至少含有一段3’UTR的trigger候选区段。

作者首先在HEK293细胞中对RADAR进行优化：确认侧翼的2A序列可提高不同传感器序列间的行为一致性，SFFV启动子可将传感器“基线”表达水平最小化至检测线以下。经共转染的从头设计trigger T1验证，发现输出蛋白的表达依赖于T1，且当细胞中缺失ADAR1时无法输出；当ADAR过表达时输出增强。作者发现ADAR1 p150异构体的输出水平最高，因此后续均使用该异构体。此外，作者还通过逆转录、测序确认该系统编辑成功，发现感受器上的UAG被编辑为色氨酸（即UGG密码子）的效率约为3%，Trigger被编辑的效率约为7%，但也检测到1%的旁编辑（bystander editing）。为进行输入-输出定量，作者测定输出量与T1质粒的输入量在两个数量级内成线性关系。作者还将输出单元替换为可进行神经生物学操作的Cre重组酶，实现输出的模块化设计。

接下来作者依次测试诱导表达型trigger、基因组表达型trigger、鼠源天然3’UTR中的trigger、及人源细胞系HEK293中内源trigger的检测效果，并进行定量评估，以便在最终的应用场景中使用。

随后作者测试该系统对人/鼠转录组的覆盖度。首先确认在dsRNA不短于72bp时RADAR仍可保持基本效果。然后猜想并验证感受器可以靶向间隔的两部分序列，从而允许系统跳过不需要的trigger RNA、识别同源但非连续的序列、及检测融合基因和可变剪切位点。最后确认当感受器序列选在与EGFR的编码序列互补时会显著降低trigger诱导成功率。综合上述结果，超过85%的人源和鼠源基因至少含有一个候选的trigger序列用于RADAR。

此外，作者还尝试对ADAR进行改造，发现使用带有编辑增强的脱氨酶结构域突变位点（E488Q）的ADAR2与MS2 RNA结合蛋白MCP的融合型ADAR，配合插入MS2序列的感受器区段，可以有效提高RADAR的编辑输出效率。

最后，作者展示RADAR的独有特征和潜在应用场景：可用于细胞分类，或连锁使用两个感受器序列执行“或”和“且”逻辑的信号输入，或者通过识别特定RNA序列（如TP53的不同变体）确定细胞状态，甚至只需更换位植物的启动子和载体即可在植物中通过匹配特定的trigger序列实现荧光信号输出，从而将RADAR的应用扩展至不含内源性ADAR基因的物种之中。

综上所述，作者利用细胞内源靶向dsRNA的ADAR编辑酶开发出一套模块化的可编程系统用于活细胞中RNA的感知。该系统可应用于小鼠和人源的多种形式RNA的检测，并具备潜在的多物种应用潜力。

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01493-x

制版人：十一

参考文献

1. Han, S.-P. et al. Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers.Mol. Ther. Nucleic Acids27, 797–809 (2022).

2. Hur, S. Double-stranded RNA sensors and modulators in innate immunity.Annu. Rev. Immunol.37, 349–375 (2019).

3. Gallo, A., et al. ADAR RNA editing in human disease; more to it than meets the I.Hum. Genet.136, 1265–1278 (2017).

4. Reautschnig, P. et al. CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo.Nat. Biotechnol.40, 759–768 (2022).

5. Loughran, G., et al. Avoidance of reporter assay distortions from fused dual reporters.RNA23, 1285–1289 (2017).

6. Vogel, P. et al. Efficient and precise editing of endogenous transcripts with SNAP-tagged ADARs.Nat. Methods15, 535–538 (2018).

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