RNA提取、RNA定量分析及RNA琼脂糖凝胶电泳（SOP）

一、RNA提取：从细胞中提取

1．仪器耗材

冷冻高速离心机和普通离心机、1.5ml离心管（DEPC处理）、1ml、200ul和10ul移液枪及枪头（DEPC处理）、磁力搅拌器，漩涡振荡器等。

2．试剂及配制

  TRIzol Reagent、三氯甲烷（分析纯）、异丙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、DEPC H2O（0.1%），PEG6000、NaCl、TES等。

3．实验步骤

首先浓缩病毒，若取20ml细胞病毒液进行浓缩：需要PEG6000：1.4g（使PEG6000的终浓度为7%）；NaCl：0.46g（使NaCl的终浓度为2.3%），4℃ 磁力搅拌1-2h后4℃过夜；

分装到1.5ml离心管中，15000g，3℃，离心20min；

弃上清，用TES溶解沉淀（约1ml），离心13000g，4min，23℃(其目的： 去除PEG6000)；

收集上清约1ml，即浓缩后的病毒液。

⑴、病毒液（500ul）与TRIzol Reagent(500ul)  1：1混合，室温放置10min；

⑵、加三氯甲烷200ul，轻轻倒置几次，室温放置10min；

⑶、4℃，12000rpm，离心15min，将上清移入另一1.5ml离心管中；

⑷、加入等体积异丙醇，轻轻倒置几次，-20℃放置2h（至少30min，时间越长越好，以沉淀RNA）；

⑸、4℃，12000rpm，离心5min，弃上清；

⑹、加70%乙醇800-900ul，洗涤一次，12000rpm2-3min？？？（4℃ 8000rpm 10min），弃上清；

⑺、自然干燥后加10ul DEPC水溶解（TE Buffer）

⑻、测定NRA含量。

4．注意事项

⑴、在浓缩病毒时，加入PEG6000和NaCl时要缓慢加入；磁力搅拌器的转速要慢；

⑵、提取RNA时，所用的枪头和1.5ml的离心管都要用0.1%的DEPC H2O处理,然后高压灭菌；抽提时，不要剧烈震荡，否则会造成RNA断裂；

⑶、在溶解RNA时，不要使RNA太干燥，只要不含有酒精就可以溶解。

整理人：张振杰    审校人：李娟

二、RNA定量分析

1. 仪器耗材

紫外分光光度计，核酸电泳仪，电泳槽，移液枪，枪头

2. 试剂及配制

空白对照液，如灭菌DEPC水或TE。

3. 实验步骤

(1) 打开紫外分光光度计，进行“连接”和设定检测波长为230nm 、260nm和280nm

(2) 在比色杯中加入空白对照和待检样品

(3) 用空白对照进行“自动调零”

(4) 测定待检样品

(5) 结果分析

在分光光度计上分别测定样品在230nm、260nm、280nm的吸收值，计算OD260/OD280及OD260/OD230的比值。纯净的RNA样品OD260/OD280的比值应在1.7-2.0之间，OD260/OD230应大于2.0。

4. 注意事项

(1) 若OD260/OD2802.0，则表明RNA被异硫氰酸胍污染。可以通过乙醇异丙醇重新沉淀去除。

(3) 对于DNA杂质的存在与否紫外分光光度计不能予以明确说明。

(4) 纯净的RNA样品（无DNA及核苷酸杂质）260nm的光吸收值等于1.0时，RNA的含量为37ug/ml，可求出RNA样品的浓度：RNA含量（ug/ml）=OD260×稀释倍数×37ug/ml。

(5) 随着技术的进步可能还有其他的检测工具及检测方法，如核酸蛋白检测仪。但是就现在

的实验室仪器，上述方法比较可行。

参考文献

1. 生化与分子生物学实验技术

2. 分子克隆

3. Takara试剂目录

整理人：周宏    审校人：李娟

三、RNA琼脂糖凝胶电泳

1. 仪器耗材

核酸电泳仪，电泳槽，微波炉，500ml三角瓶，200ml三角瓶，1000ml试剂瓶，10ml注射器，移液枪，枪头

2. 试剂及配制

0.5M EDTA（pH8.0）

称取186.1g Na2EDTA-2H2O，置于1L烧杯中，加入约800ml的去离子水，充分搅拌，用NaOH调pH值8.0（约20g NaOH），加入去离子水将溶液定容到1L，加DEPC处理，高温高压灭菌，适量分成小份后室温保存

10×MOPS Buffer                      

称量41.8g MOPS，置于1L烧杯中，加入700ml DEPC 水，搅拌溶解，使用2M NaOH调pH值至7.0，再加入1M NaOAc（DEPC处理）20ml 和0.5M EDTA（pH8.0）（DEPC）       20ml，用DEPC处理水定容到1L，用0.45um滤膜过滤除去杂质，室温保存。

注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。

10×Loading Buffer                    

在10ml离心管中加入0.5M EDTA（pH 8.0）200ul，Bromphenol Blue 25mg，Xylene Cyanol FF 25mg，加入约4ml的DEPC处理水，充分搅拌溶解，再加入5ml的甘油后，充分混匀，用DEPC水定容到10ml，室温保存。

3. 操作步骤

（1） 制备1.2% RNA凝胶

称取0.24g 琼脂糖加入20ml 1×MOPS, 微波炉里溶化。冷却到55℃加入甲醛0.2ml 倒胶。

（2） 按照下面小量上样检测加入各物质于0.2ml的离心管里，65℃水浴锅内5min，拿出置于冰上5min，放入离心机中瞬离。

小量上样检测：5× RNA Loading Buffer            5ul

               RNA                      2ul

               EB（RNA 用）                0.3ul

               DEPC处理水                 2.7ul

（3） 将凝好的胶放入电泳槽内，上样，电压约50V~70V

（4） 放入紫外灯下观测

总RNA样品中的主要成分是28s的rRNA、18s的rRNA及5s的rRNA。电泳后在凝胶上呈现三条明显的条带。在上样量少时，5s rRNA的条带有时显示不清。若在变性胶上，这三条带的迁移率分别与5.1kb、2.0kb、及0.12kb的标准RNA的迁移率相近。从量上看，溴化乙锭染色后28s rRNA条带的亮度应为18s rRNA的两倍。若没有两倍，表明样品中RNA有降解。

4. 注意事项

（1） 同提取RNA一样，电泳过程中要防止RNA的降解，所用耗材、试剂都用DEPC处理，操作时必须带一次性手套。

（2） DEPC有致癌之嫌，操作过程中要注意安全。

（3） 由于RNA的分子结构与DNA不同，因而RNA电泳时有着与DNA电泳不同之处。在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构，才能使RNA的泳动距离与其分子量数值成正比。

（4） 在不需要测定RNA分子量时使用浓度为1.0%~1.4%的非变性琼脂糖凝胶也可以将不同的RNA分子分离。当需要对所提取的RNA样品进行快速检测时可使用非变性胶。

（5） 其它注意事项同DNA的检测。

参考文献

1. 生化与分子生物学实验技术

2. 分子克隆

3. Takara试剂目录

整理人：李娟 审校人：周宏