qRT

2023-05-12 22:10| 来源: 网络整理| 查看: 265

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算；

qRT-PCR原理：

以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

Ct值是什么意思呢？

Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期，在平台期之前，PCR 扩增就是简单的指数增长，也就是 1 变 2，2 变 4，4 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方，到了平台期所有基因扩增的数目是一致的，而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。这里可以得到公式：

计算-ΔΔCt

在这里，我们有一个对照组，一个处理组，还有一个内参基因和目的基因，想看一下目的基因在处理组中相对与对照中的表达差异，也就是计算-ΔΔCt：数据如下：

1.计算每组内参基因sgAction Ct均值

计算第一个 Δct，即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值

3.计算对照CK组中 Δct 的均值，再用处理组的每一个Δct 减去刚刚计算的对照CK组的 Δct 均值，得到 ΔΔct（红框框）

4.相对表达量计算，也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct：

不难看出这里的-ΔΔct和我们转录组当中的log2（fold change）值是一致的，所以如果多做几个基因就可以绘制类似如下图：

或者相关性点图：

测试数据表格下载：qRT-PCR_demo_data.xlsx

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