PCR 常见问题总汇及解决方案

PCR 产物的电泳检测时间 一般为 48 h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48 h 后带型不规则甚致消失。 

假阴性，不出现扩增条带 

PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR 循环条件。寻找原因亦应 针对上述环节进行分析研究。 

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组 蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带， 极有可 能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘 加 Taq 酶或溴乙锭。 

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： ①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引 23 物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和 引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存， 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二 聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影 响PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 

反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩 增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失 败。

物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低， 可 致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要用标 准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补 序列，其PCR 扩增是不会成功的。

假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的PCR 产物为非 目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种 假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物 质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试 剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互 相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带 的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低， 及 PCR 循环次数 过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶 量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量， 适当增加模板量，减少循环次 数。

适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少 dNTP 的 浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。