qpcr常见问题分析与解决

2023-12-23 03:08| 来源: 网络整理| 查看: 265

反应体系引起的扩增曲线不光滑—扩增效率偏差（过高或过低）A. 扩增效率过高出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差（例如，如果采用硅胶柱纯化时，结合DNA或RNA的离液盐可抑制Taq DNA聚合酶。如果采用有机萃取法，则苯酚和乙醇残余物也具有相同的效应），可能导致出现抑制PCR反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。解决方案：去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110% 以下，则分析良好；对目的基因做标准曲线，一般用克隆的该基因的质粒做梯度稀释，或用PCR产物做梯度稀释，然后做定量扩增，通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在90%-110%;重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物。切记应延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇，或采用另外的纯化柱加入洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。

B. 扩增效率过低扩增效率过低主要表现在试剂浓度不适（主要是引物、镁和Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重实验中），引物对Tm之间的差异超过5°C以及热循环条件不适，试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现：扩增效率＜90%。解决方案：

对上述因素逐一排除后进行调整优化实验体系。

C. 个别扩增曲线异常如个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

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