Supersmart pUC57平黏端通用TOPO克隆载体 (ZS

简介：

pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。

产品特点：

（1）快速连接，最快仅需 5min；

（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；

（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；

（4）不包含任何酶切位点，便于后续亚克隆；

（5）平末端和 A 尾产物通用。

注意：引物不能磷酸化。

测序引物：

正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体图谱

操作方法: 

1. PCR 产物的纯化

1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。

1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。

1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。

2. PCR 用量和连接时间

PCR 产物大小

 PCR 产物用量

载体用量

摩尔比

连接时间

阳性率

0.1~1kb

2~10ng

1 μl

1: 5~10

5~10min

>95%

1~3kb

10~20ng

1 μl

1: 5~10

15~20min

>90%

>3kb

5ng/kb

1 μl

1: 5~10

30min

>85%

3. 连接反应

向0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂

成 分

用 量

PCR 产物

0.5~4 μl （用量参考上表）

pUC57 Simple Vector

1 μl

加无菌水至总体积为

5 μl

轻轻吹打混合均匀后，室温（25°C）孵育 5~30min，通常放置 10min。

关于 PCR 产物的用量说明：

在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连 接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效 率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。

4. 转化

4.1 取5-10 μl上一步骤的反应样品加入到50-100μl DH5α等感受态细胞中(注意所加入的DNA样品体积不要超过感受态体积的1/10)，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30 min。4.2 42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3~5 min。

4.3 加入500 μl不含抗生素的SOC或LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h。

4.4 将菌液5000 rpm离心1 min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50-100μl的培养液，重悬菌体。然后全部均匀涂布到含适当抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。4.5 第二天挑取平板上的克隆进行菌落PCR或者提取质粒进行酶切鉴定，也可以挑取至少 3 个克隆进行测序验证。

5. PCR 菌检挑选阳性克隆菌落（连接产物条带单一、清晰情况下，阳性率>95%，可无需菌检，直接测序，本步骤可省略）

5.1 用 10 μl Tip 头挑取生长良好的单个菌斑，放置于 10 μl 无菌水中吹打几次混合均匀。

5.2 取 1 μl 上述菌液于 20 μl PCR 体系中，用 PCR 特异性引物或者 M13F(-47)和 M13R(-48)鉴定阳性克隆。

PCR 反应体系

PCR 反应条件

 反应体系

用量

温度

时间

5XEffcient Taq PCR Master Mix (with Dye)

4 μl

变性

95°C

30 s

M13F(-47) (10 μM)

1 μl

循环 25~30

95°C

10 s

M13R(-48) (10 μM)

1 μl

58°C

20 s

菌液模板

1 μl

72°C

2kb/min

灭菌双蒸水

13 μl

72°C

2 min

5.3 以上述菌液为模板进行 PCR 扩增，并电泳检测（如载体自连接，则菌检 PCR 扩增长度为：140bp）。

6. 质粒提取及测序

将鉴定为阳性的菌液接种于 5ml LB 培养基中（含 100ug/ml 氨苄青霉素），37°C 振荡（225 rpm）培养过夜，提取质粒。并使用 M13F(-47)或 M13R(-48)进行测序。

常问题及分析: 

1. 问题：平板克隆数少或不长斑

原因：通常是由于感受态效价较低造成，更换感受态可解决问题。平板为 100μg/ml 氨苄青霉素抗生素，检查是否用错。

2. 问题：阳性率低

原因：连接 PCR 产物有引物二聚体、连接产物条带不明亮（浓度不够）。

3. 问题：鉴定条带大小与预期不符

原因：PCR 产物在回收过程中发生断裂，造成小片段产物，在连接大片段时尤其严重。菌检产物大小为 140bp＋目标产物 大小，如插入片段为 500bp，则菌检阳性克隆为 640bp。

4. 问题：提取的质粒是否能进行酶切鉴定

回答：该载体上不携带任何常规酶切位点，除非产物自带酶切位点，否则不能酶切鉴定。

储存：

-20℃可保存 2 年，-80℃可保存 5 年，避免反复冻融。

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