木糖诱导启动子及其质粒载体和应用的制作方法

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木糖诱导启动子及其质粒载体和应用的制作方法

2023-07-10 13:17| 来源: 网络整理| 查看: 265

技术领域：本发明属于生物技术领域，涉及一种木糖诱导启动子及其质粒载体和应用

背景技术：

启动子分为组成型启动子(constitutivepromoter)和特异性启动子(specificpromoter)。组成型启动子能在所有细胞、任何时候进行转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型启动子能够特异性诱导目的基因表达，在生物体内产生大量的特异产物，从而做出调节反应，适应外界环境或提高代谢产物的产量。

苜蓿中华根瘤菌是一种非模式菌株。目前，苜蓿中华根瘤菌诱导型启动子的研究较少，mostafavi等研究了paraa、ptaua、prhar和pmela4个启动子并比较了其功能，paraa启动子区域位于araabcdef操纵子上游，被证明是阿拉伯糖分解代谢所必需的，并且在特定培养基中阿拉伯糖可诱导100倍以上，然而，其背景表达比较高，不适合严谨调控。ptaua和pmela具有更严格的调控，但它们的表达强度较低，不适合用于过表达目的基因。prhar的表达效果最差(mostafavi,lewisetal.2014)。弱诱导型启动子在提高代谢产物产量的应用中有一定的局限性，而严谨调控的强诱导型启动子在这方面的应用更具优势。

诱导启动子在特定的物理或化学信号的刺激下，调控下游基因转录的启动和关闭，对一些细胞毒性基因的遗传操作尤为重要。诱导启动子对于遗传操作系统来说必不可少。代谢工程也需要更多的诱导启动子元件可供选择，以实现某一代谢途径各基因表达水平的精确调控。严格调控的启动子表达克隆基因，可以方便观察所需的表型，而泄露表达的启动子则会影响数据的分析。综上所述，我们需要在苜蓿中华根瘤菌中探寻高效的严格调控的诱导型启动子。

为此，本发明人经过长期研究，发现了可以应用于苜蓿中华根瘤菌和其他多种α-变形菌门菌种中的严谨调控的强诱导启动子。

mostafavi,m.,j.c.lewis,t.saini,j.a.bustamante,i.t.gao,t.t.tran,s.n.king,z.huangandj.c.chen(2014)."analysisofataurine-dependentpromoterinsinorhizobiummelilotithatofferstightmodulationofgeneexpression."bmcmicrobiol14:295.

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供两个严谨、高强度表达的木糖诱导启动子，包含木糖诱导启动子的质粒载体及其应用。本发明以苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638为模板，扩增获得了两个木糖诱导启动子序列，以绿色荧光蛋白为报告基因，对木糖诱导启动子进行了评价。本发明与文献报道的阿拉伯糖诱导启动子进行了比较。随后，用表达强度更高的一个木糖诱导启动子对hema基因在质粒和基因组水平分别进行了过表达，维生素b12产量得到了大幅提高。同时，这两个木糖诱导启动子还可以应用于苜蓿中华根瘤菌外的其他多种α-变形菌门菌种中。该发明扩展了α-变形菌门的启动子元件，对于α-变形菌门菌种中的基因表达、遗传基因操作和菌株改良有重要意义。

第一方面，本发明提供了一种木糖诱导启动子，其核苷酸序列任选自如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)所述的序列：

(a)木糖诱导启动子为序列表seqidno:1所示的核苷酸序列；

(b)与序列表seqidno:1具有75％以上一致性，且具有启动子功能的核苷酸序列；

(c)在高严谨条件下与(a)或(b)所述的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列；

(d)木糖诱导启动子为序列表seqidno:2所示的核苷酸序列；

(e)与序列表seqidno:2具有75％以上一致性，且具有启动子功能的核苷酸序列；

(f)在高严谨条件下与(d)或(e)所述的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。

优选地，所述(b)为与序列表seqidno:1具有95％以上同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列，所述(e)为与序列表seqidno:2具有95％以上同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种含有木糖诱导启动子的质粒载体，所述质粒载体为游离型或整合型载体。优选地，所述游离型载体为含有革兰氏阴性菌均可识别的复制子和mob基因的广泛宿主穿梭质粒载体，进一步优选pbbr1mcs2；所述整合型载体为携带有靶基因翼侧500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体，进一步优选puc系列质粒。

所述质粒载体还包括编码目的多肽的核酸序列。所述编码目的多肽的核酸序列包括荧光蛋白；优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

所述木糖诱导，木糖浓度为0.1～4％；优选地，木糖浓度为0.5～2％。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有第二方面所述的质粒载体。

优选地，宿主细胞为α-变形菌门；进一步优选地，为苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、新月柄杆菌(caulobactercrescentus)、脱氮假单胞菌(pseudomonasdenitrificans)、致瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)或跟黏着中华根瘤菌(sinorhizobiumadhaerens)中的一种；更优选地为苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)。

第四方面，本发明提供第一方面所述木糖诱导启动子或第二方面所述质粒载体或第三方面所述宿主细胞在木糖诱导条件下诱导启动目的基因表达的应用。

附图说明

图1：质粒载体pbbr-promoter-gfp的图谱。

图2：质粒pbbr-promoter-gfp的构建流程图。

图3：木糖启动子截短示意图。

图4：含启动子pa和hema基因的pbbr-pa-hema质粒图谱。

图5：含启动子pa和hema基因的puc18-pa-hema质粒图谱。

图6：木糖诱导启动子pa和pb在大肠杆菌中的诱导效果图。

图7：不同诱导启动子在苜蓿中华根瘤菌中受不同浓度诱导剂的诱导效果图。paraa(图a)诱导剂为阿拉伯糖、pa(图b)和pb(图c)诱导剂为木糖。

图8：木糖诱导启动子pa和pb在不同菌株中的诱导效果图。

图9：截短后的木糖诱导启动子的表达强度和诱导效果图。

图10：维生素b12的标准曲线图。

图11：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的vb12产量和生物量的结果图。

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1：含启动子质粒载体的构建

1、含报告基因载体的制备

利用表1的引物gfp-ecori-f、gfp-xhoi-r，以ece164质粒为模板，通过pcr扩增，引入ecori和xhoi酶切位点，得到绿色荧光蛋白基因gfp片段。经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的gfp片段。将纯化的gfp片段和pbbr1mcs2质粒分别用ecori和xhoi进行双酶切，将两种双酶切产物经过t4连接酶4℃过夜连接。连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-gfp。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-gfp备用。

2、含阿拉伯糖和木糖诱导启动子质粒的制备

分别利用表1的引物对paraa-xbai-f和paraa-ecori-r，pa-xbai-f分别与pa-ecori-r和pb-ecori-r，以苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638菌株的基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori和xbai酶切位点，得到阿拉伯糖诱导启动子paraa片段和木糖诱导启动子pa、pb片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的paraa、pa和pb片段。

将上述纯化的paraa、pa、pb启动子片段和pbbr-gfp质粒分别用ecori和xbai进行双酶切，将paraa、pa、pb启动子片段的双酶切产物分别与pbbr-gfp质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-paraa-gfp、e.coli/pbbr-pa-gfp、e.coli/pbbr-pb-gfp。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-paraa-gfp、pbbr-pa-gfp、pbbr-pb-gfp备用。质粒图谱如图1所示，质粒构建流程如图2所示。木糖诱导启动子pa的核苷酸序列如seqidno.1所示，木糖诱导启动子pb的核苷酸序列如seqidno.2所示，阿拉伯糖诱导启动子paraa的核苷酸序列如seqidno.3所示。

3、含截短后木糖诱导启动子质粒的制备

利用如表1所示的引物pb-xbai-f2、pb-xbai-f3、pb-xbai-f4、pb-xbai-f5、pb-xbai-f6分别和pb-ecori-r，以重组质粒pbbr-pb-gfp为模板，通过pcr，引入xbai和ecori酶切位点，得到不同长度的启动子片段f2、f3、f4、f5、f6，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的f2、f3、f4、f5和f6片段。

利用如表1所示的引物pa-xbai-f7、pa-xbai-f8分别和pa-ecori-r，以重组质粒pbbr-pa-gfp为模板，通过pcr，引入xbai和ecori酶切位点，得到不同长度的启动子f7和f8片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的f7和f8片段。

利用如表1所示的引物pa-xbai-f和pb-ecori-r2，以重组质粒pbbr-pb-gfp为模板，通过pcr，引入xbai和ecori酶切位点，得到启动子片段r2。经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的r2片段。

将纯化的f2、f3、f4、f5、f6、f7、f8和r2片段和施例1得到的带有荧光标记基因的pbbr-gfp质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将启动子片段的双酶切产物分别与带有荧光标记基因的pbbr-gfp片段经t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-f2-gfp、e.coli/pbbr-f3-gfp、e.coli/pbbr-f4-gfp、e.coli/pbbr-f5-gfp、e.coli/pbbr-f6-gfp、e.coli/pbbr-f7-gfp、e.coli/pbbr-f8-gfp和e.coli/pbbr-r2-gfp。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-f2-gfp、pbbr-f3-gfp、pbbr-f4-gfp、pbbr-f5-gfp、pbbr-f6-gfp、pbbr-f7-gfp、pbbr-f8-gfp和pbbr-r2-gfp备用(其截短示意图如图3所示)。f2、f3、f4、f5、f6、f7、f8和r2的核苷酸序列分别如seqidno.4至seqidno.11所示。

实施例2：木糖诱导启动子在大肠杆菌中的活性测定

lb培养基组分：1％胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、1％氯化钠。

将实施例1中的大肠杆菌菌株e.coli/pbbr-pa-gfp、e.coli/pbbr-pb-gfp和e.coli/pbbr-gfp(control)，在含50mg/l卡那霉素的lb固体平板上划线活化后，挑取单菌落接种至5ml含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，200r/min，37℃，培养16h。以1％的接种量将上述菌液转接至含有1.8ml的含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基的24孔板中，置于孔板摇床中37℃、700rpm、80％湿度震荡培养，待od600达到0.4-0.6时，相应地加入一定量的木糖诱导剂诱导，使诱导剂的终浓度分别为0％、1％，定时取样测定od600和荧光(细胞以4000转/分离心10分钟，弃上清，用等量双蒸馏水重悬细胞)，测定菌株在吸收波长为488nm和放射波长为523nm下的荧光表达强度。结果如图6，在加入木糖后e.coli/pbbr-pa-gfp和e.coli/pbbr-pb-gfp荧光表达强度趋势相同，荧光强度均有明显提高，且e.coli/pbbr-pa-gfp比e.coli/pbbr-pb-gfp的荧光表达强度高，说明启动子pa和pb在大肠中均有活性。

实施例3：阿拉伯糖和木糖诱导启动子在苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中的活性测定

1、转化——三亲本转化法

将实施例1中的3个质粒pbbr-paraa-gfp、pbbr-pa-gfp、pbbr-pb-gfp按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中。得到苜蓿中华根瘤菌:sm/pbbr-paraa-gfp、sm/pbbr-pa-gfp、sm/pbbr-pb-gfp。

(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体mt616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到od值为1.0左右；

(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638的菌液、mt616和大肠杆菌的菌液各500μl转移至1.5ml无菌ep管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。

(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1ml0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

(5)分别采用500μl新鲜的lb液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和mt616的沉淀进行悬浮。

(6)分别取各2μl的三种菌液，滴在不添加抗性的lb固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落pcr验证。得到阳性菌，命名为sm/pbbr-paraa-gfp、sm/pbbr-pa-gfp、sm/pbbr-pb-gfp。

2、阿拉伯糖和木糖诱导启动子在苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中的活性测定

lb/mc培养基：lb培养基补充有mgcl2(2.5mm)、cacl2(2.5mm)。

将实施例3第一部分中的三个菌株sm/pbbr-paraa-gfp、sm/pbbr-pa-gfp和sm/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，挑取单菌落接种至5ml的含卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基中。30℃、200r/min培养36h后，以10％的接种量将上述菌液转接至1.8ml的含有卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基的24孔板中，置于孔板摇床中30℃、700rpm、80％湿度震荡培养，以初始菌株苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638作为负对照。待od600达到0.4-0.6时，相应加入一定量的阿拉伯糖或木糖诱导剂诱导，使诱导剂的浓度分别为0％、0.5％、1％、2％、4％，定时取样测定od600和荧光(细胞以4000转/分离心10分钟，弃上清，用等量双蒸馏水重悬细胞)，测定菌株在吸收波长为488nm和放射波长为523nm下的荧光表达强度。结果如图7所示，随着木糖浓度从0增加到1％，sm/pbbr-pa-gfp和sm/pbbr-pb-gfp的荧光均增加。当木糖终浓度为1％时，荧光达到最大值。随着木糖浓度的增加，荧光蛋白的荧光强度随之降低。而阿拉伯糖浓度0.5％时，sm/pbbr-paraa-gfp的荧光强度最大。sm/pbbr-paraa-gfp的荧光强度要明显低于sm/pbbr-pa-gfp和sm/pbbr-pb-gfp的荧光强度。

实施例4：木糖诱导启动子在其他菌中的活性测定

1、八种菌株的制备

按实施例3中第一部分的三亲本转化法，将实施例1中的2个质粒pbbr-pa-gfp和pbbr-pb-gfp分别转入到运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、新月柄杆菌(caulobactercrescentus)、脱氮假单胞菌(pscudomonasdenitrificans)、致瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、荧光假单胞菌(pseudomonascluorescens)、豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)和黏着剑菌(ensiferadhaerens)又叫跟黏着中华根瘤菌(sinorhizobiumadhaerens)中，得到含质粒的运动发酵单胞菌：zm/pbbr-pa-gfp和zm/pbbr-pb-gfp；新月柄杆菌：cc/pbbr-pa-gfp和cc/pbbr-pb-gfp；脱氮假单胞菌：ps/pbbr-pa-gfp和ps/pbbr-pb-gfp；致瘤农杆菌：at/pbbr-pa-gfp和at/pbbr-pb-gfp；流产布鲁氏菌：ba/pbbr-pa-gfp和ba/pbbr-pb-gfp；荧光假单胞菌：pf/pbbr-pa-gfp和pf/pbbr-pb-gfp；豆科根瘤菌：rl/pbbr-pa-gfp和rl/pbbr-pb-gfp；跟黏着中华根瘤菌：sa/pbbr-pa-gfp和sa/pbbr-pb-gfp。

2、木糖诱导启动子在运动发酵单胞菌中的活性测定

将实施例4第一部分中的菌株zm/pbbr-pa-gfp和zm/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，挑取单菌落接种至5ml的含卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基中。28℃、200r/min培养16h后，以10％的接种量将上述菌液转接至1.8ml的含有卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基的24孔板中，置于孔板摇床中28℃、700rpm、80％湿度震荡培养。待od600达到0.4-0.6时，加入一定量的木糖进行诱导，使诱导剂的终浓度分别为0％、1％，定时取样测定od600和荧光(细胞以4000转/分离心10分钟，弃上清，用等量双蒸馏水重悬细胞)，测定菌株在吸收波长为488nm和放射波长为523nm下的荧光表达强度。结果见图8。

3、木糖诱导启动子在新月柄杆菌中的活性测定

pye培养基：蛋白胨20g/l、酵母提取粉10g/l、牛肉膏2g/l(ph调到7.5)。

将实施例4第一部分中的菌株cc/pbbr-pa-gfp和cc/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的pye固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

4、木糖诱导启动子在脱氮假单胞菌中的活性测定

脱氮假单胞菌培养基：kh2po42.5g/l、nacl2.5g/l、nh4cl0.5g/l、mgso40.13g/l、葡萄糖1g/l、cacl25g/l(ph调到7.0-7.2)。

将实施例4第一部分中的菌株ps/pbbr-pa-gfp和ps/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的脱氮假单胞菌固体培养基平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

5、木糖诱导启动子在致瘤农杆菌中的活性测定

yeb培养基：牛肉浸膏5g/l、酵母浸膏1g/l、蛋白胨5g/l、蔗糖5g/l、mgso4·h2o0.5g/l(ph调到7.0)。

将实施例4第一部分中的菌株at/pbbr-pa-gfp和at/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yeb固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

6、木糖诱导启动子在流产布鲁氏菌中的活性测定

流产布鲁氏菌培养基：蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、葡萄糖10g/l、氯化钠5g/l(ph调到7.5)。

将实施例4第一部分中的菌株ba/pbbr-pa-gfp和ba/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的流产布鲁氏菌培养基固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

7、木糖诱导启动子在荧光假单胞菌中的活性测定

将实施例4第一部分中的菌株pf/pbbr-pa-gfp和pf/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yeb固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

8、木糖诱导启动子在豆科根瘤菌中的活性测定

yem培养基：甘露醇5g/l、酵母抽提物0.5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、nacl0.1g/l、k2hpo40.5g/l、葡萄糖酸钠5g/l。

将实施例4第一部分中的菌株rl/pbbr-pa-gfp和rl/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yem固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

9、木糖诱导启动子在跟黏着中华根瘤菌中的活性测定

将实施例4第一部分中的菌株sa/pbbr-pa-gfp和sa/pbbr-pb-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，其后续操作同实施例4第二部分。

10、木糖诱导启动子在8种不同菌株中的表达强度分析

由图8可知，启动子pa和pb在八种菌株中对绿色荧光蛋白表达基因均有较强的启动效果，与其在苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中的趋势相同，均是启动子pa的效果强于pb的效果。两种启动子在八种菌株中的启动效果的强弱顺序为跟黏着中华根瘤菌、运动发酵单胞菌、脱氮假单胞菌、荧光假单胞菌、新月柄杆菌、荧光假单胞菌、致瘤农杆菌、流产布鲁氏菌、豆科根瘤菌。

实施例5：木糖诱导启动子核心区域的探索

按照实施例3第一部分的三亲本转化法，将实施例1中的9个质粒pbbr-f2-gfp、pbbr-f3-gfp、pbbr-f4-gfp、pbbr-f5-gfp、pbbr-f6-gfp、pbbr-f7-gfp、pbbr-f8-gfp和pbbr-r2-gfp分别转化到苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中。分别得到苜蓿中华根瘤菌工程菌:sm/pbbr-f2-gfp、sm/pbbr-f3-gfp、sm/pbbr-f4-gfp、sm/pbbr-f5-gfp、sm/pbbr-f6-gfp、sm/pbbr-f7-gfp、sm/pbbr-f8-gfp和sm/pbbr-r2-gfp。将这几株菌分别在含有固体卡那霉素100mg/l的lb/mc平板上划线活化，挑取单菌落接种至5ml的含卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基中。30℃、200r/min培养36h后，以10％的接种量将上述菌液转接至含有1.8ml的卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基的24孔板中，置于孔板摇床中30℃、700rpm、80％湿度震荡培养，以实施例3中sm/pbbr-pa-gfp和sm/pbbr-pb-gfp作为正对照，以初始菌株苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638作为负对照。待od600达到0.4-0.6时，加入一定量的木糖进行诱导，使诱导剂的终浓度分别为0％、1％，定时取样测定od600和荧光(细胞以4000转/分离心10分钟，弃上清，用等量双蒸馏水重悬细胞)，测定菌株在吸收波长为488nm和放射波长为523nm下的荧光表达强度。

结果如图9，上述含木糖启动子截断序列质粒的八株菌在加木糖和不加木糖的情况下无明显变化，与负对照苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638趋势相同。说明启动子的核心区域已被破坏。

实施例6：木糖诱导启动子的应用

1、木糖诱导启动子过表达hema基因菌株的构建

δ-aminolevulinate(ala)是合成维生素b12、血红素(heme)、西罗血红素(siroheme)等四吡咯化合物的共同前体。ala由c4或c5途径合成。c4途径中，由甘氨酸和琥珀酰coa在ala合成酶(hema)的催化下聚合生成ala。c5途径以谷氨酸作为底物，在谷胺酰-trna合成酶(gltx)的催化下，谷氨酸结合到trna分子，生成谷胺酰-trna。谷胺酰-trna在谷胺酰-trna还原酶(hema)的作用下，还原成谷胺醛(glutamate1-semialdehyde)，再经谷胺醛氨基转移酶(heml)的催化生成ala。苜蓿中华根瘤菌中存在c4途径，ala合成酶(hema)是ala合成的关键酶，故我们利用木糖诱导启动子pa过表达hema基因，以期增加ala的合成，进一步提高维生素b12的产量。

(1)sm/pbbr-pa-hema菌株的构建

利用如表1所示的引物对pbbr-f、pa-r和引物对hema-f、hema-r，分别以重组质粒pbbr-pa-gfp和苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr，得到线性化的pbbr-pa和hema片段。经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的线性化的pbbr-pa和hema片段。将两片段通过gibson组装连接在一起。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于卡那霉素50mg/l平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-pa-hema。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-pa-hema备用(其质粒图谱如图4所示)。再按照实施例3的三亲本转化法将其转化到苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中。从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落pcr验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌，命名为sm/pbbr-pa-hema(sm1)。hema基因的核苷酸序列如seqidno.12所示。

(2)sm/phbc::pa-hema菌株的构建

利用表1的引物puc18-f/r，以puc18质粒为模板，通过pcr得到puc18片段序列。经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的线性化的puc18片段。利用表1的引物phbc-f1/r1、pa-f1/r1和hema-f1/r1，以苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638菌株的基因组为模板，通过pcr扩增,得到phbc、pa和hema结构基因序列。通过胶回收得到纯化的phbc、pa和hema序列。将以上四个片段通过gibson试剂盒连接，将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于氨苄霉素100mg/l平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，得到的阳性菌命名为e.coli/puc18-pa-hema。用质粒试剂盒提取质粒puc18-pa-hema备用(其质粒图谱如图5所示)。再按照实施例3的三亲本转化法将其转化到苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中。质粒puc18-pa-hema作为同源重组中供体dna片段的来源，phbc基因序列作为同源重组中的同源臂，通过单交换同源重组将木糖诱导启动子pa和结构基因hema整合到苜蓿根瘤菌的染色体基因组上，从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落pcr验证。将得到的发生单交换同源重组的菌株保存，命名为sm/phbc::pa-hema(sm2)。

(3正对照菌株的构建

按照实施例3的三亲本转化法，将实施例1中的质粒pbbr1mcs2转化到苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中，得到正对照菌株——苜蓿中华根瘤菌:sm/pbbr。

2、苜蓿中华根瘤菌的培养条件

将sm1、sm2菌株在无菌条件下用接种针分别在含卡那霉素100mg/l和氨苄霉素200mg/l的lb/mc固体培养基上划线，30℃恒温静置48h培养，获得单菌落。分别用接种针挑取单菌落于装有5ml含有卡那霉素100mg/l和氨苄霉素200mg/l的lb/mc液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养36h。将种子培养基按照10％比例分别接种至含有卡那霉素100mg/l和氨苄霉素200mg/l的30ml发酵培养基中。30℃震荡(220r/min)培养144h后收集菌体并检测产量。以sm/pbbr作为正对照，相应的培养条件同sm1，苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638作为负对照，培养时不加抗生素，其它条件同其他菌株。

3、检测方法

(1)样品预处理

取10ml发酵液，加入8％的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各2.5ml摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl2％的nacn(w/v)至1毫升的上清液中。

(2)标准品的制备

配置梯度维生素b12标准品(20mg/l，50mg/l，100mg/l，150mg/l)。

(3)hplc检测条件

c18-250a柱(agilent，4.6mmid9×250mm，5μm)。流动相为70％有机相(乙腈)和30％无机相(乙酸钠水溶液)，吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8ml/min，进样量20μl。

(4)维生素b12标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行hplc检测，绘制峰面积a-vb12浓度标准曲线。以测得的峰面积a为纵坐标，维生素b12质量浓度c(mg/l)记为横坐标，绘制维生素b12标准曲线。见图10，得回归方程y＝19.846x-80.857，r2＝0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素b12标准曲线计算样品产量。

4、不同苜蓿中华根瘤菌菌株生产vb12的比较

由图11可知，负对照的维生素b12的产量为110mg/l，正对照sm/pbbr的维生素b12的产量为91mg/l。实验菌株sm1菌株，其维生素b12的产量最高，为122mg/l，较负对照菌株提高了10.9％，较正对照菌株提高了34.07％。实验菌株sm2菌株，维生素b12的产量为115mg/l，较负对照菌株提高了4.5％，较正对照菌株提高了26.37％，较sm1菌株降低了5.74％。负对照的od600为60.81，正对照的od600为52.34，sm1的od600为57.9，sm2的od600为64.53。说明质粒对菌株有一定的代谢负担。但质粒上过表达hema基因能显著提高菌株生产维生素b12的能力。将hema基因整合到基因组上后，由于拷贝数没有质粒表达时高，产量比sm1略有下降，但是比负对照有明显提高。进一步证明了本发明中木糖诱导启动子的可用性。

序列表

中国科学院天津工业生物技术研究所

木糖诱导启动子及其质粒载体和应用

2019

siposequencelisting1.0

2048

dna

sinorhizobiummeliloti

cctttcctaggtcgaaaaatctatctgaatcaaatatttaaggtgtcgaatcccctgtct60

ccggacagccgtgcggcgctccgttttccacgtctcgcggatttttgatttacgtacatc120

agaaattcctctaaaggcagaacccggaggaaaacatgcgcccgacagttcacgatatcg180

ctgctagagccggggtcagcctcgcgaccgtcgaccgggttctgaacaaccggccgggcg240

tgcgtggtgtcacccgcgacaaggtcgagcgcgccatcgaagcgctcggctatgtgcgcg300

acgtcgccgccgccaacctcgccaagagccggatctacccgctggtcttcatcctgccgg360

agggcgacaacaccttcatgcgcggtcttgcggccgaggtggaggcggcgaaggcgcgct420

cggcagtcgagcgcacggcgatcacggtcttgtccgtccgggccttcgacccggaagcgt480

tagctgcagcgcttcataaagcgcgggcgcttgacccggccggcgtcgcggtcgttgcga540

tcgatgcgcccgaggtcgtcagtgcggtagatgcgctgcgtgaagacggcgtcgccgtcg600

tgacgttggtttccgacctgccggggtcgtcgcgcgatcatttcgccggtgtcgacaacg660

ttgccgccggccggaccgccggcaccctgatggggcgtttcctcggtggccgaaacggcc720

cggtggcgatcgtagccggctcgatgctggtgcgcgaccatcgcgaccgtctcgaaggct780

ttggcgcggccatggcagaaagtgcgcctggccgccggctgctgcccgtcgtcgaaggcc840

atgacgatccggctgaggtcgatcgcctcgtctccaaccttctcgccgatcaaccggagc900

ttgccggcatctacagtctcggcgccggcaatcgcggcctgatcgcggcactggaaaagg960

caggtcgcgaaaaggctgtctgcgccatcgctcatgaactgacgccgcacagccgcgcgg1020

cacttctgtccggcacgctcgacgcactcctcaatcaggacggcggccatgaggtgcgca1080

gcgccatccgggtgctgaaggcccgcgccgacggcctttcggtgatcggggcgcaggagc1140

gcatccgcatcgaaattttcctgaaggacaacctgccggtcgatccggcgtagcgctttg1200

aatttacgcagttctttcgaagaattgctcaatggaggcaagcatgtatctcggactgga1260

tctcggcacctcgggcgtcaaggcaatgttgatcgatggcggccagcgcatcgtcggttc1320

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gctttcggcggtgcgcggtatcggcctttccggccagatgcacggtgcgacgctgcttga1500

tgccgacgaccgggtgcttcggccctgcatcctctggaacgacacccgcagcttccgaga1560

ggcggcagcgctcgatgcggacccgcagttccgcgccatcaccggcaacatcgtcttccc1620

cggcttcaccgcaccgaagcttgcctgggtgcgggccaacgagcccgacatcttcgccaa1680

ggtgcgctgggtgctgctgccgaaggattatctgcgcctgtggctgaccggcgagcacat1740

gtcggaaatgtccgacagcgccggcactgcctggctcgataccggcaagcggcagtggtc1800

ggaaagcctgcttgccgccaccgacatggacgaaaagcagatgccgagcctggtcgaggg1860

aaccgatgcggccgggaagttgcgttcggaactggccgcgcgctggggcatttccggtga1920

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