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Q&A Q-1:pGK系列敲除质粒的几款产品之间的区别在哪呢? A-1:Cat. No. :GP0131~GP0140 都是应用于哺乳动物细胞敲除系统的, GP0132和GP0128带有 Puro 抗性,GP0131带有 Neo 抗性,GP0139和GP0140带有 EGFP+Puro 抗性。添加这些抗性可以对转化效率比较低的细胞进行初筛,以提高阳性克隆筛选的效率。 Q-2:靶位点设计有哪些注意事项? A-2:目前有几个在线设计软件,我们推荐使用Zhang Feng lab:http://crispr.mit.edu/,该软件会对每一个潜在的靶位点打分,并告知是否存在脱靶现象。在设计oligo序列时,需要特别注意由于H1 promoter的转录起始位点为A,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是A,应在设计上游引物时加上一个T。由于U6 promoter的转录起始位点为G,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G,应自行加一个G上去。另外score的高低并不代表敲除效率的高低,所以为提高敲除的成功率,一般选择3~5个Guide序列,先构建3~5个单敲除载体。后续先在pool细胞的基础上验证出有效的位点,再拿有效的两个位点构建双敲载体,做正式电转,筛选单克隆。 Q-3:转染效率低,怎么办? A-3:因为Cas9蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(10kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下,尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。所以,我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer,所以不推荐使用;Life的Neon系统不错,但是因为耗材是镀金的,所以非常贵;而Genloci的细胞电转仪,转染效率高,一次成本投入,后续转染耗材便宜,操作也方便,尤其适用于难转染的细胞系。 Q-4:单个细胞不生长,怎么办?A-4:对于单细胞不长的细胞进行敲除,首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞;也可以使用Cell Plaza®单细胞培养板,可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行,建议对细胞进行改造,加快其分裂速度,让单细胞可以很容易生长后,再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。 Q-5:在做高通量样本时,如何才能快速筛选得到阳性克隆?A-5:建议使用错配酶进行筛选,可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶:Cruiser®基因敲除检测错配酶、T7E I和Surveyor酶。其中,Cruiser®基因敲除检测错配酶和Surveyor酶属于Cel I家族,这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中,T7E1的特异性较差,容易出现假阳性的结果,这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度;Surveyor酶较贵,并且货期较长,所以我们推荐Cruiser®基因敲除检测错配酶,它特异性高且价格合理。 |
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