【王老师带你玩转FlowJo®】之脱胎换骨的细胞增殖分析

1.2 VPD 450检测：

BD生物科学的BD Horizon™ VPD 450是一种非荧光的酯化染料，同样可以被吸收进入细胞。染料一旦进入细胞内部，酯酶会切割酯基，将染料变成细胞内的荧光产品。随着细胞的复制，细胞内的染料数量逐渐减少，形成了特征的图案。由此，我们可以采用多色流式技术从有限的样品量中获得更多的数据。

1.3 BrdU检测：

Brdu是5-溴脱氧尿嘧啶核苷，BrdU可代替胸腺嘧啶渗入DNA的合成，BrdU荧光抗体检测渗入量，反映细胞增殖情况。此外Brdu可以在分析细胞周期时让S期更为精准。

(点击图片可放大查看）

//2.FlowJo®细胞增殖分析平台

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BD FlowJo®

通过以上实验获得相关数据后，分析时手动标记操作繁琐并且不精准。这时就可以用到FlowJo V10的增值分析工具（Proliferation Tool）。

2.1 确定“第0代”峰

增殖实验通常将使用未刺激的样品开始分析，以确定“第0代”峰。第0代高峰代表未分裂的细胞，在增殖实验中收集的样本中应该有相对一致的强度和CV。在增殖实验中，在未受刺激峰周围画一个线性门门来设置“0代”峰。

2.2 策略应用到相关样本

上一步操作完成后会在workspace中形成一个增殖分析node。双击node可以打开增殖分析窗口。拖动node可以将分析策略应用到相关样本。

2.3 数据自动分析和手动微调

FlowJo®首先会拟合出代表该群体的最优峰比和CV。这些可以手动调整和修复，以便它们在扩散分析中保持一致。还需要调整峰值的数量，以表示分析中出现的峰值的数量。通常，FlowJo®将设置一个接近预期0.5%的峰值比率。预计细胞每分裂一次，两个子代细胞中的每一个都会有一半的染色量，因此它们的信号强度也会减半。

2.4 自动生成每个增殖峰的细胞门

“Create Gates”按钮可以用来快速地在代表每个增殖峰的细胞群上创建门。

2.5 图像选项优化结果图

图形选项通过添加峰值数或Draw Model Sum来影响增殖显示，Draw Model Sum将增殖峰值的重叠相加，创建一个类似于原始数据的形状。

2.6 增殖统计数据获得

与增殖分析相关的统计信息显示在增殖窗口的右侧。下面将对它们进行更详细的解释。上面一组统计数据显示了增殖分析中常用的分析值。中间一组统计信息显示用户设置的统计值。底部的统计数据包括均方根(RMS)和与每个峰值相关的细胞计数，因为它代表了扩散模型与原始数据之间的差异。

2.7 数据结果导出

可以将增殖node拖放到layout editor窗口中，以创建增殖结果图及其相关的统计信息。还可以将增殖节点拖放到table editor中，以生成增殖平台中使用的统计数据表。

2.8 增殖数据定义

Division Index：分裂指数是指原始细胞群中细胞分裂的平均次数。即使对于从未分裂的细胞也是平均水平。（例如：包括未分裂的细胞峰)。

Proliferation Index：增殖指数是细胞分裂的总数除以进入分裂的细胞数。增殖指数只考虑了至少经历过一次分裂的细胞，也就是说，只有增殖的细胞才反映在增殖指数中。这是一个很有用的进行样本间比较的值，因为它只考虑增殖的细胞。 增殖指数更真实地反映了样本中增殖细胞的生物学特性;分裂指数反映了整个样本等状况。

Peak CV：增殖峰CV是峰的变异系数。所有峰值的CV值都相同。通常情况下，这个数字是4-7%。

Peak ratio：增殖峰比率是后续峰之间的荧光比率。例如：0.5表示n峰的荧光量是n - 1峰的一半。比值> 0.5是没有生物学意义的，通常出现在log amp不是很好。所以该值应该接近0.5。

2.9 增殖数据案例分析

举例：作为增殖指数和分裂指数如何计算的例子，如下:

G0 = 15888

G1 = 32922

G2 = 1364

G3 = 897

*培养开始时的细胞数:15888 + (32922/2)+ (13647/4)+ (897/8)= 35872.875

*分裂细胞总数:(32922/2)*1 + (13647/4)*2 + (897/8)*3 = 23620.875

*进入分裂的细胞数:35872.875 - 15888 = 19984.875

*分裂指数:23620.875 / 35872.875 = 0.66

*增殖指数:23620.875 / 19984.875 = 1.18

如果模型对数据拟合不理想，可以通过调整模型参数得到较好的拟合模型。

与FlowJo®中的所有其他平台一样，增殖node可以通过拖动应用于一组样本。每一代都可以双击node打开图表单独分析。

2.10 增殖文献分享

- Interpretation of Cellular Proliferation Data: Avoid the Panglossian. Mario Roederer, Cytometry Part A, 79A: 95 101, 2011

- Assessing Antigen-Specific Proliferation and Cytokine Responses Using Flow Cytometry. Allsopp and Langhorne, Edited by Denise Doolan, Malaria Methods and Protocol, p. 409

- Antigen/Mitogen-Stimulated Lymphocyte Proliferation. Whiteside, Measuring Immunity, Chpt. 31 p. 364

- Use of Cell-Tracking Dyes to Determine Proliferation Precursor Frequencies of Antigen-Specific T Cells. Givan, Fisher, Waugh, Bercovici, Wallace. Flow Cytometry Protocols 2nd Ed. p.109

- Proliferation Assays Based on BrdU Incorporation or CFSE Labeling. Maecker, Immunotherapy of Cancer, Disis, p.62

- Monitoring T Cell Proliferation. Hodgkin, Hawkins, Hasbold, Gett, Deenick, Todd, Hommel. Analyzing T Cell Responses By Dirk Nagorsen, Francesco M. Marincola, p. 122

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以上就是王老师为大家带来的FlowJo®增殖分析平台全面的全面解析，希望能够给每一位流式工作者带来帮助。最新升级版FlowJo®增殖分析平台平台尽在V 10.7版本，快来下载体验吧！

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