怎么设计荧光引物

一般为

15-30

个核苷酸，在做长片段

PCR

或做某些特殊的

PCR

时应使用较长的引物，但最

多不超过

50

个核苷酸

同一碱基连续出现不应超过

5

个

GC

含量一般

35-65% 

GC

含量太低导致引物

Tm

值较低，使用较低的退火温度不利于提高

PCR

的特异性

GC

含量太高也易于引发非特异扩增（

G≡C 结合形成

H

键，亲和力大）。

一般要求：55℃

-

65℃。

计算：

对于低于

20

个碱基的引物，

Tm

值可根据

Tm=4(G+C)+2(A+T)

来粗略估算

对于较长引物，

Tm

值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是

现有的引物设计软件最常用的计算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) 

- 273.15 

引物二聚体

尽可能避免两个引物分子之间

3’端有有较多碱基互补

发夹结构

尤其是要避免引物

3’端形成发夹结构，否则将严重影响

DNA

聚合酶的延伸

引物的延伸从

3’端开始，因此

3’端的几个碱基与模板

DNA

均需严格配对，不能进行任何

修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致

PCR

扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，

引物

3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。

引物

5’端可以有与模板

DNA

不配对碱基，在

5’端引入一段非模板依赖性序列。

5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点

5’端加上适当数量的保护碱基）。

5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。

5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。

过去认为，引物

3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故

3’端最好为

G

或

C

。

现在的观点认为，引物的

5’端应是相对稳定结构，而

3’端在碱基配对的情况下最好为低

稳定性结构，即

3’端尽可能选用

A

或

T

，少用

G

或

C

。

仅仅

3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸

的。

如果

3’端为富含

G

、

C

的结构，只需

3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，

造成假引发

保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别

特异性：避免非特异性扩增

模板

DNA

的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开

这些区域。

扩增区域的自由能（△G。）小于

58.61kJ/mol 

引物

Tm

值与

PCR

产物

Tm

值相差一般不超过

30℃