设计引物怕踩坑？这3款在线软件轻松扫雷！

3、外显子内含子（Exon/intron）

如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处，可在此处设置成为Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。

4、特异性（Specificitycheck）

在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。

这里提供了7种数据库：

RefSeq mRNA，Genome (referenceassemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。

前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G的绝对值。

No.2 Primer3 Plus

推荐指数：五颗星

理由：严格的qPCR引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在3‘端设计引物，产物的长度在300bp以内等。本在线软件可满足qPCR引物设计的要求。

网址：

http://www.primer3plus.com/

1、选择Run latest Versionof Primer3Plus，就进入了设计引物的主页面，合理的使用，［］，｛｝符号使引物设计符合自己的要求，大家可以在具体实战中，深入体会这几个符号带来的方便。

2、避免多个重复碱基出现，避免4个或超过4个G出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数，如产物长度：不应该超过400bp，最好100-150bp；GC％：30％-70%，最好45%－55%；引物长度：18-25bp，最好22-24bp；TM值：58-60℃，最好60℃；3’端：3’端至少4个碱基保守，最好为T，C，G。

3、点击右上放绿色按钮，可获得若干对引物，并按照5’到3’的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。可以根据荧光定量引物要求，尽量选择G、C结尾的引物合成，如下图中红框所示，还可以在序列图中看到引物的位置。

4、设计好引物后，我们要进行NCBI blast 引物验证，进入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

5、点击Basic BLAST中的nucleotideblast选项，在下面框中，按照5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔20个以上n。

6、选择物种数据库，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物种）。

7、选择Somewhat similar sequences (blastn)

8、点击Algorithm parameters, 在Expect threshold 输入1000，在Word Size 输入7。Word size不是字体大小的意思，应该理解为读长，按照7个一组核苷酸序列放到GeneBank中进行比对。

9、点击BLAST，开始比对，出现结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。

No3 PrimerBank

推荐指数：五颗星

理由：哈佛大学的一个qPCR引物数据库，目前有超过20万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为82.7%。尽量选择这种验证过的qPCR引物，qPCR品质比较有保障。

网址：

http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

搜索类型这里，可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。以小鼠的beta-actin为例。

1、首先，到NCBI上找出β-actin的gene ID，如图，选择gene,输入beta-actin：

点击右边的分类musmusculus：

结果就出来了，小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。

2、把11461输入到primerbank里面试试：

在这个结果上我们可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。

3、若是改输入beta-actin的NCBI gene symbol：actb，也可以得到相同的结果，往下拉我们还能看到经过验证的引物：

4、点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息：

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