磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用【掌桥专利】

技术领域

本发明属于基因工程和分子生物学领域，具体涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，含有突变体的表达载体、宿主细胞，以及利用该突变体生产以草酰乙酸为前体的目标化合物的方法。

背景技术

四碳回补途径是连接糖酵解途径和TCA循环的关键途径，同时草酰乙酸是许多氨基酸和有机酸的关键前体，通过强化四碳回补途径，可以提高以草酰乙酸为前体的目标化合物积累，比如赖氨酸(Becker J,Zelder O,Hafner S,Schroder H,Wittmann C.MetabEng,2011,13(2):159-168.)、苏氨酸(Lee KH,Park JH,KimTY,Kim HU,Lee SY.Mol SystBiol,2007,3:149.)和谷氨酸(Yokota,A.,Sawada,K.and Wada,M.Adv Biochem EngBiotechnol,2017,159,181-198.)以及琥珀酸等一些有机酸(Millard CS,Chao YP,LiaoJC,Donnelly MI.Appl Environ Microbiol,1996,62(5):1808-1810；Yin X,Madzak C,DuG,Zhou J,Chen J.Appl Microbiol Biotechnol,2012,96(6):1527-1537)。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)是四碳回补途径重要的关键酶之一，可以将磷酸烯醇式丙酮酸和HCO

发明内容

针对现有技术的问题，为了获得更多的有助于提高以草酰乙酸为前体的化学品的积累的PEPC突变体，发明人利用前期构建的生物传感器，通过对PEPC构建随机突变文库，筛选获得若干优势突变体，均有助于提高赖氨酸、谷氨酸积累且基本不影响生长的PEPC突变体，部分突变体的性能优于之前报道的突变体。在此基础上，完成本发明。

本发明的目的在于提供一种新的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，含有该突变体的表达载体、宿主细胞，以及利用该突变体生产氨基酸的方法。

第一方面，本发明提供了一种新的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体为如下组中的任一个：

在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽中至少存在一种如下突变的氨基酸：

Arg300His,Asn806Ser，或

Lys152Glu,Ser625Pro,Ala674Thr，或

Ala200Val,Val606Ala,Ser625Pro，或

Phe356Ser,Asn663Ser，或

Lys701Arg,Lys702Glu,Asn806Ser，或

Ala545Val，或

Ala589Val，或

Ile254Val，或

Gly17Asp,Asn559Asp，或

Ile9Leu，或

His708Arg,Ser757Leu,Phe799Leu，或

Ala78Thr,Tyr214His,His685Arg，或

Glu381Gln,Ile726Thr,Asp805Tyr。

2)在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失一个或多个碱基，且至少具有1)中所述的任一个突变的多肽。优选地，在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失1、2、3、4、5、6个碱基。

3)与SEQ ID NO:1所示多肽具有至少90％以上同源性，且至少具有1)中所述的任一个突变的多肽。优选地，同源性至少在95％以上、至少96％以上、至少97％以上、至少98％以上、至少99％以上。

在一个具体的实施方式中，本公开提供的优选的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且具有如下任一种突变的多肽：

Arg300His,Asn806Ser，或

Lys152Glu,Ser625Pro,Ala674Thr，或

Ala200Val,Val606Ala,Ser625Pro，或

Phe356Ser,Asn663Ser，或

Lys701Arg,Lys702Glu,Asn806Ser，或

Ala545Val，或

Ala589Val，或

Ile254Val，或

Gly17Asp,Asn559Asp，或

Ile9Leu，或

His708Arg,Ser757Leu,Phe799Leu，或

Ala78Thr,Tyr214His,His685Arg，或

Glu381Gln,Ile726Thr,Asp805Tyr。

第二方面，本公开提供了编码上述突变体的多核苷酸。

第三方面，本公开提供了含有上述突变体的表达载体。

第四方面，本公开提供了含有上述突变体的宿主细胞。

在一个实施方式中，所述宿主细胞为埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物。

在进一步的实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌，可选地，所述宿主细胞的出发菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067、谷氨酸棒杆菌Z188及其衍生菌株。

第五方面，本公开提供了一种生产以草酰乙酸为前体的目标化合物的方法，其特征在于，所述方法包括在第一方面的突变体、第二方面的多核苷酸、第三方面的表达载体存在的情况下生产目标化合物，或培养第四方面的宿主细胞使之生目标化合物。可选地，还包括将目标化合物从培养基中分离出来的步骤。

在进一步的实施方式中，所述以草酰乙酸为前体的目标化合物包括但不限于氨基酸、有机酸或其衍生物，优选包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，优选有机酸包括琥珀酸、α-酮戊二酸、苹果酸、延胡索酸等，优选衍生物包括但不限于戊二胺、5-氨基酸戊酸、戊二酸等。

综上，本公开提供了第一方面的突变体、第二方面的多核苷酸、第三方面的表达载体、第四方面的宿主细胞和第五方面的生产方法在生产以草酰乙酸为前体的目标化合物中的用途。

本公开的有益效果

1.本公开获得的PEPC突变体可显著提高以草酰乙酸为前体的目标化合物的产量(例如赖氨酸、谷氨酸)，且基本不影响菌株的生长，因此，可进一步降低以草酰乙酸为前体的目标化合物的生产成本，具有较好的工业应用潜能。

2.本公开获得的PEPC突变体，为以草酰乙酸为前体的目标化合物的菌株构建提供了新的思路。

附图说明

图1 PEPC随机突变文库流式细胞仪分析结果。

图2 PEPC突变体文库96孔板复筛突变体荧光强度分析。

具体实施方式

术语定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然本公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

本公开的术语“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶”指的是催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO

此外，本公开的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体不仅可以包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，还可以包括与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，只要它们存在本公开的任一种突变。显而易见的是，与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽具有基本上相同或相应生物学活性的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围。本发明的术语“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶”、“PEPC”、“PPC”意思相同，可以互换。

本公开的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

本公开的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。

本公开的术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的PEPC是指氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽。

本公开的术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。

在一些实施方式中，本公开的“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变(subsititution)或点突变(point mutation)。

术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。

如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第150位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第150位就可能是第156位。

本公开的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

本公开的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

本公开的术语“宿主细胞”是指包含本公开的PEPC突变体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。

本公开的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl

本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够包含本公开的PEPC突变体的细胞即可。在一些实施方式中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产以草酰乙酸为前体的目标化合物(例如L-氨基酸)的微生物，可以包括埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等的菌株，但不限于此。优选地，可以是具谷氨酸棒状杆菌。作为优选地，可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌Z188及其衍生菌株等。示例地，所述衍生菌株可以是任何菌株，只要该菌株具有生产以草酰乙酸为前体的目标化合物(例如L-氨基酸)的能力。

示例地，宿主细胞为生产赖氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产赖氨酸的宿主细胞，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的衍生菌株。此外，生产赖氨酸的宿主细胞也可以是具有赖氨酸生产能力的其他种类的菌株。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a.编码乙醇脱氢酶的adhE基因；

b.编码乙酸激酶的ackA基因；

c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；

d.编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；

e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；

f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；

g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；

h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；

i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；

j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和

h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；

b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；

c.编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；

d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；

e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；

f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；

g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；

i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。

示例地，宿主细胞为生产谷氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产谷氨酸的宿主细胞，可以是谷氨酸棒杆菌Z188，也可以是谷氨酸棒杆菌Z188的衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产谷氨酸的宿主细胞中可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码谷氨酸脱氢酶gdh基因；

b)编码谷氨酰胺合成酶glnA基因；

c)编码谷氨酸合酶gltBD基因；

d)编码异柠檬酸脱氢酶icdA基因；

e)编码乌头酸水合酶acnA/acnB基因；

f)编码柠檬酸合酶gltA基因；

g)编码丙酮酸羧化酶pyc基因；

h)编码丙酮酸脱氢酶aceEF/lpdA基因；

i)编码丙酮酸激酶pykA/pykF基因；

j)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapA基因；

k)编码葡萄糖磷酸异构酶pgi基因。

在一些实施方式中，所述生产谷氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或消除：

a)编码异柠檬酸裂解酶aceA基因；

b)编码α-酮戊二酸脱氢酶kgd基因；

c)编码乳酸脱氢酶ldh基因；

d)编码谷氨酸脱羧酶gad基因。

示例地，宿主细胞为生产脯氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产脯氨酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产脯氨酸的宿主细胞中可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码解除反馈抑制的谷氨酸激酶proB基因；

b)编码谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA基因；

c)编码吡咯-5-羧酸脱氢酶proC基因；

d)编码谷氨酸脱氢酶gdh基因；

e)编码丙酮酸羧化酶pyc基因；

f)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因；

g)编码l-脯氨酸外排蛋白thrE或serE基因。

在一些实施方式中，所述生产脯氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a)编码脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因；

b)编码L-谷氨酸外排蛋白mscCG基因；

c)编码转运蛋白proP/proY/proU基因。

示例地，宿主细胞为生产羟脯氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产羟脯氨酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产羟脯氨酸的宿主细胞中可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码脯氨酸羟化酶的基因；

b)编码解除反馈抑制的谷氨酸激酶proB基因；

c)编码谷氨酸-5-半醛脱氢酶proA基因；

d)编码吡咯-5-羧酸脱氢酶proC基因；

e)编码谷氨酸脱氢酶gdh基因；

f)编码丙酮酸羧化酶pyc基因；

g)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapN基因；

h)编码铵转运蛋白amtB基因；

i)编码转运蛋白proP/proY/proU基因。

在一些实施方式中，所述生产羟脯氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a)编码脯氨酸脱氢酶/吡咯-5-羧酸脱氢酶putA基因；

b)编码L-谷氨酸外排蛋白mscCG基因；

c)编码L-脯氨酸外排蛋白thrE或serE基因。

示例地，宿主细胞为生产苏氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产苏氨酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产苏氨酸的宿主细胞中可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码天冬氨酸激酶III lysC基因；

b)编码天冬氨酸半醛脱氢酶asd基因；

c)编码天冬氨酸激酶I thrA基因；

d)编码高丝氨酸激酶thrB基因；

e)编码苏氨酸合成酶thrC基因；

f)编码天冬氨酸氨基转移酶aspC基因；

g)编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd基因。

在一些实施方式中，对于生产苏氨酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产苏氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或消除：

a)编码二氢二吡啶合成酶的dapA基因；

b)编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；

c)编码乙酸激酶的ackA基因；

d)编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；

e)编码转录调控因子tyrR基因。

示例地，宿主细胞为生产5-氨基乙酰丙酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产5-氨基乙酰丙酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产5-氨基乙酰丙酸的宿主细胞中可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a)编码5-氨基酸丙酸合成酶hemA基因；

b)编码丙酮酸羧化酶pyc基因；

c)编码泛酸激酶coaA基因；

d)编码苏氨酸/高丝氨酸转运蛋白rhtA基因；

e)编码半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸转运蛋白eamA基因；

f)编码丙氨酸:乙醛酸转氨酶agt基因。

g)编码抗氧化相关蛋白的基因。

在一些实施方式中，对于生产5-氨基酸丙酸的宿主细胞，可以是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌，也可以是其衍生菌株。在一些实施方式中，所述生产5-氨基酸丙酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或消除：

a)编码琥珀酰辅酶A合成酶sucCD基因；

b)编码琥珀酸脱氢酶sdhAB基因；

c)编码5-氨基乙酰丙酸脱水酶hemB基因；

d)编码异柠檬酸裂解酶aceA基因；

e)编码苹果酸合成酶aceB基因。

本公开的术语“以草酰乙酸为前体的目标化合物”包括但不限于氨基酸、有机酸及其衍生物，所述氨基酸包括天冬氨酸家族氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)，谷氨酸家族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、谷氨酸酰胺)，以及5-氨基乙酰丙酸等，所述有机酸包括琥珀酸、α-酮戊二酸、苹果酸、延胡索酸等，所述衍生物包括但不限于戊二胺、戊二酸等。通过本发明的方法，可以提高菌株的以草酰乙酸为前体的目标化合物的产量。

本公开的术语“培养”可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

除非在公开中另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施例)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1.赖氨酸生物传感器的构建和改造

根据已报道的eyfp基因序列信息(GeneBank No.CCD28585.1)做全基因合成，利用引物eyfp-F/eyfp-R PCR扩增得到eyfp基因片段；以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组(Gene ID:2830649)为模板，利用lysGE-F/lysGE-R为引物PCR扩增得到lysGE基因的片段；以质粒pTRCmob(Qian Liu,et al.,J Biotechnol,2007,132,273–279)为模板，利用pTRCmob-Rev-F/pTRCmob-Rev-R为引物PCR反向扩增全长质粒，得到线性化载体片段。上述三个片段纯化回收后，利用重组酶将质粒载体、lysGE基因片段和eyfp基因片段连接，经转化、酶切及测序验证正确的重组载体命名为pLysGE。设计点突变引物LysGE-mut-F/R，以pLysGE为模板，通过PCR反向扩增、片段纯化及转化，得到对赖氨酸响应浓度范围变宽和响应强度显著增强的赖氨酸生物传感器pLysGE58。该赖氨酸生物传感器的响应原理为，当胞内的赖氨酸浓度较低时，调控蛋白LysG不能与赖氨酸结合，从而不能通过调控lysE基因启动子启动荧光蛋白基因的转录；当胞内的赖氨酸达到一定浓度后，调控蛋白LysG与赖氨酸结合，从而使LysG的构象发生变化，进而与lysE的启动子结合，启动下游报告基因黄色荧光蛋白的表达。

实施例2.pepc基因敲除菌株构建

根据文献中公开的赖氨酸菌株构建方法(Becker,J.,et al.Metab.Eng.,2011,13,159-168)，利用基于pK18mobsacB的同源重组技术将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上天冬氨酸激酶(lysC基因编码)第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，构建获得一株具有一定赖氨酸合成能力的菌株SCgL30。为了排除基因组表达的野生型PEPC对质粒过表达的PEPC突变体产生干扰，我们利用文献中报道的基于CRISPR-Cas9的基因敲除方法(Liu,J.,etal.Microb.Cell Fact.,2017,16,205)，将SCgL30基因组的pepc基因敲除。具体实验过程如下：

(1)pepc基因敲除质粒pgRNA-Δpepc构建

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别设计引物pepc-up-F/R和pepc-down-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得用于pepc基因敲除的上游和下游同源臂片段；同时以pgRNA2(Liu,J.,et al.Microb.Cell Fact.,2017,16,205.)为模板，利用引物pepc-pgRNA-2/pepc-pgRNA-3扩增骨架片段1，利用gRNA-pepc/pgRNA-1为引物扩增带有pepc-sgRNA(N20,5′-CGTGCGGGATCAGCGGACGA-3′)的骨架片段2。将上述四个片段纯化回收后重组连接，得到用于pepc基因敲除质粒pgRNA-Δpepc。

(2)SCgL30菌株染色体上的pepc基因敲除

将敲除质粒pCas9(Liu,J.,et al.Microb.Cell Fact.,2017,16,205)和pgRNA-Δpepc通过电脉冲方法共同转化入菌株SCgL30的感受态细胞，加入1mL46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6min，30℃孵育3h，涂布含有50μM IPTG；25μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素的TSB固体培养基，30℃培养2天，获得重组的转化子。其中TSB培养基成份为：葡萄糖，5g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9g/L；尿素，3g/L；丁二酸，0.5g/L；K

实施例3.PEPC及其突变体表达载体构建

根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计引物pepc-tac-F/R，以ATCC13032基因组为模板，通过PCR扩增获得pepc基因片段。根据质粒pXMJ19的序列信息设计引物pXMJ19-Rev-2F/2R，以质粒pXMJ19为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段，上述两片段回收后重组连接，获得pepc过表达载体pXMJ19-pepc。

根据文献报道的解除了天冬氨酸和苹果酸反馈抑制的PEPC突变体信息(Yokota,A.,Sawada,K.and Wada,M.Adv Biochem Eng Biotechnol,2017,159,181-198；Chen,Z.,Bommareddy,R.R.,Frank,D.,Rappert,S.and Zeng,A.P.Appl Environ Microbiol,2014,80,1388-1393)，分别设计D299N和N917G突变体的突变引物D299N-F/R和N917G-F/R，以pXMJ19-pepc为模板PCR扩增质粒片段，回收后转化E.coli DH5α感受态细胞，分别获得PEPC

实施例4.PEPC随机突变文库的构建

以含有pepc基因的重组载体pXMJ19-pepc为模板，利用引物pepc-mut-2F/2R，在添加0.05-0.5mM的MnCl

实施例5.PEPC随机突变文库流式细胞仪分选

将实施例4中获得的不同突变率的PEPC随机突变文库按照等摩尔比例混合，电脉冲转化入菌株ZPCgL1/pLysGE58，30℃复苏2h，将复苏液转接含有25μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素的TSB液体培养基，30℃培养16h，得到用于筛选的菌株文库。将阴性对照菌株ZPCgL1/pLysGE58/pXMJ19和ZPCgL1/pLysGE58/pXMJ19-pepc以及突变体文库菌株接种含有25μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素的TSB液体培养基，30℃培养8h后，转接到装有1mL CGXⅡ培养基(含25μg/mL卡那霉素、5μg/mL氯霉素和25μM ITPG)的24孔板中，30℃孔板摇床培养6h，其中上述CGXⅡ培养基成分为：50g/L glucose,16.5g/L NH

实施例6.PEPC突变文库复筛及对赖氨酸合成的影响

将前面经过流式细胞仪分选得到的单细胞菌落，随机挑取部分单克隆接种装有200μL TSB液体培养基(含有25μg/mL卡那霉素和5μg/mL氯霉素)的96孔板，同时接种空质粒对照菌株ZPCgL1/pLysGE58/pXMJ19、野生型PEPC过表达菌株ZPCgL1/pLysGE58/pXMJ19-pepc以及阳性对照菌株ZPCgL1/pLysGE58/pXMJ19-pepc

表1 PEPC突变体及其赖氨酸产量

实施例7.PEPC突变体表达载体构建

为验证上述实施例中获得的PEPC突变体在生产其他以草酰乙酸为前体的目标化合物中的效果，我们随机选取了上述实施例中获得的2-50和5-66突变体，对这两个突变体在谷氨酸生产中的效果进行了测试。

首先，根据pepc基因的序列，设计引物pepc-250-F/R，分别以含有2-50和5-66突变体的菌株为模板，通过PCR扩增获得相应的基因片段。根据质粒pXMJ19的序列信息，设计引物pepc-pXMJ19-F/R，以质粒pXMJ19为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段，上述两片段回收后重组连接，获得PEPC突变体表达载体pXMJ19-pepc

实施例8.PEPC野生型及突变体过表达菌株构建

采用文献报道的方法(Ruan Y,et al.Biotechnol.Lett.,2015,37:2445-52.),制备谷氨酸高产菌株Z188(NCBI Reference Sequence:NZ_AKXP00000000.1)的感受态细胞，向上述制备获得的Z188感受态细胞分别电转化1μg的PEPC突变体表达载体及对照载体pXMJ19和pXMJ19-pepc涂布含有5μg/mL氯霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得重组菌株Z188/pXMJ19、Z188/pXMJ19-pepc、Z188/pXMJ19-pepc

实施例9.PEPC突变体表达对谷氨酸合成的影响

为了测试谷氨酸棒杆菌过表达PEPC突变体对菌株产谷氨酸的影响，分别对实施例8获得的重组菌株进行发酵测试。种子培养基成分为：葡萄糖，50g/L；磷酸，0.7g/L；硫酸铵，10g/L；MgSO

表-2过表达PEPC突变体菌株及其谷氨酸发酵产量

表3本公开实施例中所用的引物

此外，本实施例只是给出了PEPC突变体提高赖氨酸、谷氨酸产量的一个示例，如前所述，由于草酰乙酸是许多氨基酸和有机酸的关键前体，通过强化四碳回补途径，可以提高以草酰乙酸为前体的目标化合物积累，比如赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸、以及一些有机酸等，因此，本领域技术人员均可知，应用本公开的PEPC突变体也同样可以增加以草酰乙酸为前体的目标化合物的产量，应用本公开的PEPC突变体生产以草酰乙酸为前体的目标化合物的方法也在本公开的保护范围内。

以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

中国科学院天津工业生物技术研究所

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用

CPCN21411230

1

PatentIn version 3.5

1

919

PRT

谷氨酸棒杆菌

1

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Gly Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Lys Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

660 665 670

Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala

690 695 700

Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Thr Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915