PCR技术问题汇总

1.2退火（复性）

模板变性成单链后，温度快速降至退火温度，引物与模板DNA 单链的互补序列可发生结合。退火温度的选择至关重要，如果退火温度太高，引物不能与模板很好地结合，扩增效率将会非常低；如果退火温度太低，引物将产生非特异性结合，从而导致非特异性DNA 片段的扩增。退火时间一般为30-60s ，足以使引物与模板之间完全结合。

1.3延伸

模板- 引物结合物在Taq 酶的作用下，沿着5’→3’ 的方向合成一条与模板DNA 链互补的链。延伸时的温度常为72℃ （Taq 酶的最适温度为72℃-78℃ ）。在最适温度下，Taq 酶的聚合速率约为2000bp/min 。但作为一个由经验确定的规则是，靶基因的每1000bp 的扩增产物的延伸时间被设计为1min 。另外，延伸时间随扩增片段长短而定，甚至在所扩增目的基因的长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。

重复循环“变性→ 退火→ 延伸”过程就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。大多数PCR 含25-40 循环，过多易产生非特异扩增。在最后一个循环后，反应在72℃ 维持5-10min ，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

问题2 在PCR技术操作中，是否需要能量，需向溶液中加ATP吗？

DNA 分子在PCR 仪中扩增与在细胞内复制相似，也需要原料、能量、酶、引物、适宜的温度和pH 等，但PCR 技术操作中不需要单独提供ATP 作为供能物质。在PCR 技术中，DNA 复制的解旋断裂氢键的能量来自PCR 仪的加热，高温达90℃~95℃ 时DNA 分子双链即打开，dNTP 的连接能量来源于Taq 酶聚合基本单位dNTP 加入到延伸链的3\\\\\\\\' 端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi ，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这两个反应互相偶联，推动Taq 酶聚合单体延伸DNA 分子。

问题3 PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么作用？引物会在PCR仪中复制吗？

引物是在DNA 分子复制时起引导作用一段短RNA 或单链DNA 片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其3’ 端开始合成新的核酸链。细胞内的引物是RNA 链，由RNA 酶根据DNA 链碱基序列自动合成。

在PCR 技术中，引物是人工合成的两段寡核苷酸链序列，是单链DNA 片段。由于DNA 聚合酶的特异性和DNA 分子两条链的两端的差异性，决定了DNA 分子体外扩增时必需设计两种引物，分别与DNA 分子两条模板链的两端的感兴趣区域互补，以利于DNA 聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引导作用。对于一段需扩增的DNA 的核苷酸序列，引物可根据这一序列经计算机设计并合成，使其能有效地扩增模板DNA 序列，引物设计的优劣直接关系到PCR 技术扩增DNA 的成功与否。引物不会在PCR 仪中复制，引物是设计并配比好后加入PCR 仪溶液中的。体外人工设计的引物广泛用于DNA 聚合酶链反应（PCR 技术）、测序和探针合成等。

问题4 PCR引物的设计有遵循什么原则？

尽管有很多因素可影响PCR 扩增反应的效率与特异性，但最关键的因素要数引物的设计。引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA 中的靶序列退火形成稳定的结构时才能达到这个目的。

引物设计主要遵循如下原则：

①引物的长度一般在18~25bp ，太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。

②引物G+C 含量以40%-60% 为宜，太少扩增效果不佳；过多则易出现非特异条带。4 种碱基最好随机分布。

③两条引物之间不能有连续4 个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链而得不到目的基因片段。

④一条引物自身不能有大于4bp 的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR 条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。

⑤两条引物的退火温度相差不能大于5℃ 。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。

⑥引物3\\\\\\\\' 端的性质非常关键，如果可能的话，最末及倒数第二个碱基的最佳选择是G 和C 。

⑦实际应用中最重要的一点，设计的引物在合成之前，有必要在DNA 数据库中进行BLAST 检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。

问题5 为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？PCR的引物是DNA？

细胞内DNA 分子复制过程可概括为：（1 ）双链的解开；（2 ）RNA 引物的合成；（3 ）DNA 链的延伸；（4 ）切除RNA 引物，填补缺口并连接相邻的DNA 片段。迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所发现的DNA 聚合酶，都必须有模板链和3\\\\\\\\'-OH 末端的引物链存在，才能合成新的DNA 链（由5’→3 ’方向延伸）。这就需要在DNA 复制起始阶段由RNA 聚合酶首先合成一小段RNA 为引物，RNA 引物就提供了这个羟基，DNA 聚合酶Ⅲ 才会真正开始DNA 链的合成。

在细胞中只有RNA 聚合酶可以从头合成RNA ，合成的RNA 与模板链结合，从而引导DNA 分子子链的延伸。而DNA 聚合酶由于它的保真系统决定它不能从头合成DNA 单链，所以DNA 复制时先由RNA 聚合酶合成一段RNA 链，再由DNA 聚合酶起到DNA 分子复制时的延伸功能，形成互补的子链。

在PCR 仪中用的是DNA 引物，是人工设计合成，一般不用RNA 作为引物，因为RNA 引物需要被切除，而PCR 仪中没有这种酶，再说，若用的RNA 引物被切除后将使这个新合成的DNA 的两端都出现了一段单链而不稳定。

问题6 退火温度如何选择？

退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，它是影响PCR 特异性的重要因素。退火温度的高低需要多方面考虑，主要取决于引物的长度、碱基组成等，一般以引物的Tm 值（引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度）为参考，计算公式为:Tm/℃=4 （G+C ）+2 （A+T ）。

由公式可以看出，当引物长度一样时，G+C 碱基含量高的引物退火温度高。理想状态下退火温度应控制在既能保证引物的有效退火，又能减少非特异性结合。G-C 碱基对之间的氢键比A-T 碱基对的氢键多，为了确保G+C 含量高的引物错配后能够有效从模板链上脱落下来从而减少非特异性扩增，其应该选择的退火温度就相应高一些。

有时为了避免对每对引物进行最佳退火温度的优化与测定，常采用降落PCR 。降落PCR 的起始温度高于计算的Tm 15℃ 左右，在接下来的循环中，每一个循环退火温度降低1℃ ，直到达到一个较低的退火温度（低于Tm 5℃ ），该温度称为“touchdown PCR” 退火温度。

然后在该温度下继续10 个左右循环。该策略的目的在于确保第一个引物- 模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异性扩增，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物已经有几何级数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

问题7 高中生物学教材中提及的PCR技术有哪些应用？

7.1 PCR 是基因工程中获取目的基因的方法之一

从PCR 扩增过程来看，在最初的两个循环中，从一条引物开始的DNA 链延伸往往要超越与另一条引物互补的序列；从第三个循环开始出现第一个与两条引物之间的长度相同的DNA 分子；接下来的循环，与两条引物之间的长度相等的DNA 片段（含目的基因）将以几何级数方式被扩增与积累。所以，只需了解目的基因的上下游序列以便设计引物对，使目的基因处于两条引物之间，即可通过PCR 技术以少量生物DNA 为模板获取大量目的基因，而没必要知道目的基因的全部序列。

7.2在基因水平上利用PCR技术对蛋白质进行定点诱变改造

基因突变技术是蛋白质工程中的重要技术之一，可以有目的地改变DNA 序列中的碱基，从而改造天然蛋白质，使之更符合人类需求。

任何基因，只要目的基因两端及需要变异部位的序列已知，就可用PCR 诱变去改造基因的序列。在需要诱变的位置合成两条带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与目的基因上下游的两条引物作PCR ，这样得到的两个产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR 就能得到诱变的PCR 产物。该方法简便易行，准确高效，已成为最常用的定位诱变方法。

7.3基因检测技术为防止癌症等疾病提供了新的手段

自PCR 技术问世以来，建立于PCR 技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得的是极微量的组织也可经PCR 扩增而进行各种检测，为疾病诊断提供新的手段。

来源：生物铭师堂

编辑：彭草

|参考文献来源：

1.沈静丹. 浅谈PCR技术[J]. 生物学教学,2014,39(02):58-59.

2.吉祖筠.教材中“PCR技术”中的教学释疑[J].理科考试研究·综合版,2016。返回搜狐，查看更多