巢式PCR的优缺点及注意事项

巢式PCR的优点：

　　1、克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性;

　　2、由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性;

　　3、内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因引可以保证整个反应的准确性及可行性。

　　巢式PCR的缺点：

　　1、进行第二次PCR坟增引起交叉污染的几率大。为了克服此缺点，可彩用同一反应管中巢式PCR，主要利用内外引物Tm值不同。

　　2、如果你已排除引物，酶，RNA提取，逆转录等等其他原因引起的PCR不成功，确定关键原因是模板量低的话，可以用巢式。

　　巢式 PCR 注意事项

　　1、如果要提高扩增效果，具备回收的条件的话，回收后继续第二次 PCR是没有问题的。如果不具备回收条件，不回收直接稀释后进行二次 PCR也可， 因为内引物同样具有相当的特异性，如果设计合理，第一次非特异性的扩增产物为模板，不能和第二对引物有效结合，这样的非特异产物的模板不能在第二次扩增中产生目的条带。

　　2、在第一轮PCR结束之后，将PCR产物稀释1 000倍(视情况而定)作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR的产物同样稀释1 000倍(视情况而定)作为第三轮PCR的模板，这样依次类推。实际操作中可以搞3轮甚至更多，当然做3轮是比较合适了，这个时候PCR的产物已经是高度特异性了。