PCR扩增实验报告(八篇) | 您所在的位置:网站首页 › pcr扩增的目的基因实验报告 › PCR扩增实验报告(八篇) |
PCR扩增反应的操作实验报告 实验原理: 以单链DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热,使模板DNA在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在Taq DNA聚合酶的催化下,以dNTP为原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的DNA片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。 实验步骤:一、PCR反应的条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1. 温度与时间的设置 (1) 变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 一般情况下,93℃~94℃ lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。 (2) 退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变 性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 …… …… 余下全文 |
CopyRight 2018-2019 实验室设备网 版权所有 |