第三章 巢式PCR

PCR技术的出现给研究样品中的微量基因提供了一个强大的武器，但在某些情况下，对于许多靶序列来说，用一对引物扩增的产物仍不足以通过凝胶检测观察到，在这种情况下，就需要用到巢式PCR（nested PCR）技术了［1］。

巢式PCR是一种PCR改良模式，利用两套引物对，包含两轮PCR扩增，首先对靶DNA进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增，第二次PCR引物与第一次反应产物的序列互补（见图3－1），第二次PCR扩增的产物即为目的产物。

图3－1　巢式PCR原理示意图

使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15～30个循环的标准扩增，将一小部分起始扩增产物稀释100～1000倍（或不稀释）加入第二轮扩增中进行15～30个循环。或者，也可以通过凝胶纯化对起始扩增产物的大小进行选择。两套引物的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少，而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30～40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了一些有难度的PCR（如5' RACE）的特异性。

① 模板：基因组DNA或cDNA。

② dNTP混合液：每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L。

③ 四条特异引物：两条外引物，两条内引物，浓度均为10μmol/L。

④ Taq DNA聚合酶及其10×PCR缓冲液。

⑤ 高压灭菌去离子水。

⑥ PCR扩增仪。

⑦ 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

巢式PCR的引物设计原则与常规PCR相同。通常内引物与外引物间隔多长距离也没有统一的要求，具体情况根据每个实验而定。

一般使用经过提取的基因组DNA或合成的cDNA。

① 设立50μL的PCR反应体系，在0.25mL的PCR管中，分别加入：

如果PCR仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约50μL）。将PCR试管放入PCR仪中。

② 设置PCR反应条件：

PCR反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成1000bp左右。

③ 进行第二轮PCR反应，在0.25mL的PCR管中，分别加入：

PCR反应条件同第一轮。

④ PCR产物的检测

反应结束后，用10μL第二轮PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

注意事项同常规PCR。

巢式PCR所需条件与常规PCR相同，但与常规PCR相比，通过连续多轮扩增进一步提高了反应的特异性与灵敏性。对于在分子生物学研究与医学检测中，利用常规PCR方案难以扩增出的样品，可以尝试使用巢式PCR进行扩增与检测。

巢式PCR大多应用在当模板DNA含量较低时，用一次PCR难以得到满意的结果，这时用巢式PCR的两轮扩增可以得到很好的效果。范金水等分别用常规PCR和巢式PCR检测我国8个城市184例肝炎病人，其阳性率分别为9.1%～23.5%和31.8%～62.5%，说明巢式PCR的敏感性要高于常规PCR［2］。程保平等比较了三种PCR方法的柑橘黄龙病菌检测效果，发现巢式PCR法兼具常规PCR的优点（低成本、大规模）和实时荧光定量PCR的优点（检测灵敏度高），但是操作较复杂，适合技术熟练的研究者使用［3］。

在临床检测中，还会用到单管巢式PCR方法，单管巢式PCR是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物为25bp，退火温度比较高（68℃），巢式内侧两个引物为17bp，退火温度较低（46℃），PCR反应液的其他成分与一般PCR相同。这样，通过控制退火温度（68℃）使外侧引物先行扩增，经过20～30次循环后（第一次PCR），再降低退火温度（46℃）使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增。该PCR的灵敏度可达到每毫升样品检出0.3个淋球菌，而传统的一步PCR法只能检测到3个淋球菌。