设计引物就来瞅瞅功能强大的Oligo7

软件介绍

oligo7是一款著名的引物设计软件，主要用来设计和分析序列和PCR引物，合成基因和各种探针，包括小分子干扰核苷酸和分子信标的工具。程序具备基于最近邻热力学数据，低聚糖的搜索算法寻找最佳引物PCR，包括TaqMan、高度多路复用，共识或简并引物，支持多个文件的批处理，适合于生物学中的应用。

Oligo软件使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒，oligo7更是出现了三个图，分别是：Tm图、ΔG图和Frq图。

其功能包括：

1.分析TM和内部稳定性，绘制溶解温度图和稳定性图。

2.给出寡核苷酸的重要相关信息。

3.显示正向引物、反向引物和当前的Oligo里潜在的连接物，潜在的二聚物也可显示出来。

4.分析显示在选中的正向引物或反向引物中基本的成份和溶解温度。

5.精确地分析出生物信息软件中的错配位点。

6.正向引物和反向引物选中后，能自动产生PCR实验条件和PCR产物信息。

引物设计

01

打开Origin7，点击“File”下拉菜单里的“New Sequence”，将序列粘贴在窗口里如图四，点击“√”就可以进入分析界面。

02

新界面里点击“Search”,点击“for Primers & Probes”如图五左上，然后界面弹出图五右上，点击“Parameters”和“Ranges”，根据反应条件设置参数，一定要修改引物长度，防止引物过短，我习惯修改为图四下，然后点击“Search”就可以自动得到结果。

03

Oligo7自动给出了可能的引物对，只需要点击右侧框内“Score”，引物按软件认为的优劣进行排序，你可以看到引物的关键信息，比如长度，Ta值，GC含量。我这里参数设置少所以图六内结果多，一般限定多个参数后，软件只给出几对引物。

分析引物并选择

选择一条引物，点击上方“Analyze”，然后点击“Key info”内的“Selected Primers”，会弹出两条引物的序列和其他概括信息如图七。这里需要确保|3`△G|≤9kcal/mol，以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。

满足图七后，要继续进行6项分析以确保自己的引物是最合适的，如下图所示。

01

二聚体形成分析：为了防止引物之间相互形成二聚体，我们需要点击“Duplex Formation”分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3，如下图右。求稳的话还要分析“Upper Oligo”和“Lower Oligo”,那样可以阻止上下游引物之间形成二聚体。

02

发卡结构分析：为了阻止发卡结构形成，需要选择菜单内“Hairpin Formation”，分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”，一样要确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。

03

碱基组成与Tm值：点击图八中的3的“Composition & Tim”分析，按规矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其实实际中，引物GC含量70%我也扩成功过，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以请根据自己实际情况抉择，在Oligo7里分析的结果给出的参数很多，你只要看下图左里红圈的两个参数即可。

04

错误引发位点：点击“False Priming Sites”即可以分析。个人感觉实践中意义不大，因为往往正确概率很高如上图右，错误概率即使达到130问题也不大，所以大家这里自己抉择吧。

05

PCR总览：如果你的引物有太明显的问题，在这个界面的“Comments”下方白框里会出现如下图右的红字提示，那么你就需要根据提示修改或者更换引物。如果没有，则会和下图左“Comments”内为空白，你只需要根据这里提供的Tm值，然后减5，就是你设计的这条引物的退火温度。

06

内稳定性：上述分析完后，点“Internal stability”这个选项，最好弹出来的曲线图像如下图：中间高两边低的弧形，这样的引物稳定性高，成功概率更高，其实实践中如果做不到问题也不是很大。