自然杀伤（NK）细胞的来源、扩增技术以及符合GMP标准的制造方法的进展

自然杀伤（NK）细胞作为一种具有直接杀伤恶性细胞能力的天然免疫细胞，越来越被认为是一种极具前途的免疫治疗工具，目前已经正在进行各种临床试验。然而NK细胞作为肿瘤治疗武器的临床应用存在一些局限性：(1)这些细胞只占外周血白细胞的一小部分，需要大量的NK细胞才能达到临床疗效；(2)NK细胞需要被充分激活才能诱导肿瘤细胞的杀伤。为了获得大量的高纯度和高细胞毒性的NK细胞，人们已经开发出了几种策略。这些策略包括使用细胞因子−抗体融合、饲养细胞或膜颗粒来刺激NK细胞的增殖和增强其细胞毒作用。各种材料，包括外周血单个核细胞(PBMCs)、脐带血(UCB)、诱导多能干细胞(iPSCs)和NK细胞系，已被用作产生NK细胞用于免疫治疗的来源(图1)。此外，还开发了促进NK细胞增殖的基因修饰技术，以增强NK细胞的功能。在这里，我们就NK细胞的各种来源、扩增方案、GMP制造等方面的进展作一简要介绍。

图1. 不同来源的NK细胞的优势和局限性

01 PBMC来源的NK细胞体外扩增

PBMC是NK细胞的主要来源之一，具有采集相对容易、易于体外扩增、无毒副作用等优点。然而，NK细胞在PBMCs中的比例只有10%-15%。扩增PBMC来源的NK细胞的各种方法已经被开发出来（图2），例如使用细胞因子和饲养层细胞或膜颗粒的组合来刺激NK细胞的体外扩增。这些不同的扩增系统显示出相当不同的NK细胞扩增效率水平。

图2. 扩增PBMC来源的NK细胞的一些方法

细胞因子是维持NK细胞存活和支持NK细胞体外增殖的关键成分，而不需要滋养细胞。然而，当使用不同的细胞因子和培养条件时，发现具有不同的扩增效率。单独使用IL-15或IL-2等细胞因子对NK细胞的扩增相对温和。在含有0.5%人AB血清和2813 IU/ml IL-2的KBM-501培养液中，NK细胞在14天内扩增效率约为200倍。

除了使用细胞因子的策略外，还探索了其他选择，包括照射的肿瘤细胞、同种异体PBMCs和淋巴母细胞衍生物作为饲养细胞来促进体外NK细胞的扩增。缺乏人类白细胞抗原表达的K562细胞通过激活共刺激信号促进NK细胞的增殖。据报道，当K562细胞作为饲养细胞与IL-2和IL-15联合使用时，NK细胞的扩增超过300倍。

此外，肿瘤细胞膜颗粒也是肿瘤细胞系扩增NK细胞的有效替代品，其不仅保持了诱导NK细胞扩增的膜受体的激活效率，而且避免了肿瘤细胞与扩增产物混合的风险。

目前，PB-NK细胞体外扩增最长可达15周，扩增后的PB-NK细胞最大产量可达1×1013个, 然而，一个更好的放大效果可以通过对PB-NK细胞进行基因修饰来实现。借助基因修饰，可以延长体外扩增时间，产生更多的细胞，从而减少细胞因子的用量。

Fujisaki 等人的研究结果表明，编码人端粒酶逆转录酶基因TERT可以影响PB-NK细胞的扩增时间。将TERT导入扩增7天的PB-NK细胞，恢复了NK细胞增殖，其在体外可持续扩增150周。在另一项研究中，可MyD88/CD40(IMC)修饰的NK细胞的增殖能力更强。经照射的K562细胞扩增8天后，经IMC修饰的NK细胞数量是未修饰NK细胞的3倍。

最近，为了实现符合GMP标准的基因工程NK细胞的生产和促进CAR NK细胞的临床应用，越来越多的研究使用CliniMACS Prodigy设备在一个封闭的系统中集成了包括PB-NK细胞纯化、转导和培养在内的多个步骤。

除了Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy设备外，还有其他特殊的培养平台，如Zellwerk ZRP平台及其生物反应器类型。基于这个Zellwerk平台的NK细胞的扩增导致了GMP条件下的大规模生产，并允许在功能封闭的环境中进行细胞培养和分离。

02 脐带血来源的NK细胞的体外扩增  

有两种不同的方法可以从脐带血中获得大量的NK细胞。

一种方法是在脐带血中扩增NK细胞，另一种方法是诱导脐带血CD34+造血干/祖细胞分化为NK细胞，然后再扩增。

虽然脐带血NK细胞表达较低水平的KIR、NKG2C、DNAM1、黏附分子和IL-2Ra，而CD94/NKG2A和CXCR4表达水平高于PBMC来源的NK细胞。脐带血NK细胞的比例约为15-20%，略高于PBMC。此外，体外扩增的UCB-NK细胞在某些条件下的细胞毒性与PB-NK细胞相似。

细胞因子如IL-2、IL-5和IL-21的单一或简单组合已被用于扩增UCB-NK细胞。然而，由于这些条件下的有限扩张，新的无饲养层扩张系统正在开发中。IL-2、链球菌和唑来膦酸盐刺激脐血单个核细胞3周，可产生平均纯度为95%的NK细胞，扩增倍数为1561倍。这种无饲养层的方法降低了将其他类型的细胞引入最终产品的风险，但NK细胞的纯度仍需提高。

对CB-NK细胞进行遗传修饰可以获得更好的体内持久性，主要集中在TGFβR和IL-15信号通路上。已有研究报道，在TGFβ存在的情况下，表达阴性TGFβR的CB-NK细胞可以继续发挥其抗肿瘤作用。过表达截短的TGFβRII结构域的CB-NK细胞可在体内持续约2个月。

总部位于荷兰的Glycostem Therapeutics是世界上第一家建立完全封闭系统的、符合GMP标准的平台，用于从新鲜的脐带血干细胞生产同种异体NK细胞。在该系统的基础上，从新鲜脐血中分离出CD34+细胞，并在Xuri生物反应器中进一步分化为成熟的NK细胞。NK细胞在40天内从单个脐带血单位扩增并产生高达1.1×1010个NK细胞。在GMP洁净室使用了聚氯乙烯无菌连接装置以及C-Flex Bioward和密封器。在这种封闭的系统中，细胞永远不会暴露在开放的环境中，旨在避免污染的风险。

03 NK细胞系的扩增         

NK-92是第一个获得FDA批准用于临床试验的基于NK细胞的免疫疗法，是一种同质的永生化NK淋巴瘤细胞系，可以在体外扩增以获得大量细胞。NK-92细胞表面标志CD56和CD25阳性，CD3、CD4、CD8、CD16、CD32、CD64和HLA-DR阴性。因此，NK-92细胞的生长依赖于IL-2。这使得它们在细胞治疗中具有潜力。

然而，它们的致癌特性引起了安全问题，需要在患者给药之前对NK-92衍生细胞产品进行辐射，这反过来又可以对其在体内的长期持久性和整体治疗潜力产生负面影响。另一个缺点是，由于缺乏CD16的表达，NK-92细胞缺乏通过ADCC介导细胞杀伤的能力。

NK-92细胞建立后，在添加牛血清、马血清、氢化可的松、肌醇、叶酸和IL-2的α-MEM中培养。细胞在大约24小时内翻了一番，并且可以在体外持续增殖超过18个月，大约每周更换两次培养液。然而，由于该扩增体系含有动物源性成分，不适合作为临床级扩增体系。

NK-92细胞由于依赖于IL-2的增殖，在培养中可以很容易地扩增，并且在透气袋、细胞瓶或生物反应器中符合GMP的NK-92细胞的增殖是直接的。研究人员已经优化和验证了与符合GMP标准的转基因表达CAR的NK-92细胞生产相关的工艺。添加人血浆和IL-2的GMP级X-Vivo 10培养液能够有效地扩增NK-92细胞，并在很长一段时间内保持特异性细胞毒作用和稳定的CAR表达(>98%)。大量的NK-92细胞培养在预先装满X-Vivo 10培养液的VueLife 750-C1袋中，然后长途运输，对K562细胞保持了高杀伤率(>90%)和高存活率(>90%)。

04 从iPSCs或ESCs中扩增NK细胞         

除了从外周血和脐带血中或使用NK细胞系获得NK细胞外，还可以从PSCs中诱导NK细胞，从而实现现成生产。

研究表明，PSC来源的NK细胞不仅具有原代NK细胞和NK细胞系的优点，而且没有它们的问题。PB-NK和UCB-NK细胞很容易获得，但扩增的NK细胞的数量和纯度受供者的影响很大，而且产物通常是异质性的。NK细胞系的细胞是同质的，在患者的治疗中经常需要抑制这种细胞的增殖，但这也会影响抗肿瘤活性。

尽管研究表明PSCs分化出的NK细胞表现出不成熟的表型，如较高水平的NKG2A表达，但PSCs可以被诱导分化为类似于原始NK细胞，如表达多种NK受体(NKG2D、TRAIL、CD16等)的iPSC-NK细胞。

总之，iPSC或胚胎干细胞(ESC)来源的NK细胞由于能够提供同质的、高度细胞毒性的NK细胞产物而引起了广泛的关注。

目前认为PSCs向NK细胞的分化分两个阶段进行，第一阶段PSCs分化为造血祖细胞(HPC)，第二阶段HPC分化为NK细胞(图3)。这种分化实验的培养时间大约为5-8周，其纯度>90%。

图3. PSCs向NK细胞的分化过程

研究表明，处于分化阶段的PSC-NK细胞仅有少量扩增，约为5-40倍。因此，有必要采取额外的措施来扩增NK细胞，以获得足够的NK细胞用于临床前或临床治疗。目前，feeder systems主要用于扩增PSC-NK细胞，饲养细胞包括转基因、照射后的K562细胞和照射后的PBMC。

转基因的iPSCs可以保持良好的多能性。iPSC或ESC来源的NK细胞为PSC阶段的基因修饰提供了一个方便的基因操作平台。一系列研究表明，IL-15和CIS的修饰可以通过降低细胞因子需求来提高PSC-NK细胞的增殖能力。

Fate Treateutics是一家专注于将iPSCs应用于免疫细胞治疗的公司。该公司的符合GMP标准的制造设施是为生产现成的细胞产品而设计的。Fate Treateutics的FT516产品是第一个获得FDA批准进行临床试验的基因工程iPSC衍生NK细胞疗法产品。迄今为止，除了Fate Treateutics取得的进展外，iPSCs来源的NK细胞产品的GMP生产一直非常有限，因为大多数与iPSCs相关的研究仍处于科研阶段。

结语  

基于自然杀伤(NK)细胞的免疫治疗是治疗多种癌症的一种很有前途的方法。与T细胞不同，NK细胞通过主要组织相容性复合体(MHC)不依赖的机制识别靶细胞，并在不致敏的情况下可以直接杀死细胞。为了获得大量的高纯度和高细胞毒性的NK细胞，人们已经开发出了多种策略。

不同的来源材料也为NK细胞治疗策略的设计提供了丰富的多样性选择，以满足不同患者群体和疾病适应症的需求。为了进一步提高NK细胞的临床治疗效果，对NK细胞的基因修饰正在迅速发展。由于相对较高的安全性和现成生产的高可行性，基因修饰的NK细胞将会成为下一代具有巨大潜力的癌症免疫疗法。

来源丨生物前哨

作者丨Dara

编辑丨Dara