在NCBI利用Primer

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Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。这个工具整合了Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。将设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。

Primer-BLAST可以从两种途径进入：

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

小编此前发布这篇，就看到很多粉丝在后台上留言，问怎样在NCBI上设计出引物呢？所以下面小编为大家讲讲用primer-blast设计引物。

Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）、primers（引物区）和specificitycheck（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。

target template

在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列、FASTA格式或Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

primer

引物是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段可与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3‘末端向后进行DNA合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，所以当退火温度不合适或引物设计不合理时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的扩增。

如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏，可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小、Tm值等。

specificity check

先讲讲引物的特异性，那就是引物结合模板正确位置的能力，或者避免结合非目标位置的能力。影响引物特异性的因素包括引物长度、GC含量、碱基分布、Tm值等。

在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。

这里提供了4种数据库：

RefSeq mRNA,

Genome (selected reference assemblies)

Genome (all chromosomes)

nr (the standard non-redundant database)

当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

selected reference assemblies 包括以下的物种：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。

EXAMPLE

人尿嘧啶DNA糖基化酶的两个转录本序列

uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374

UNG1的accession number: NM_003362

UNG2的accession number: NM_080911

这里用UNG1的序列设计引物，选择RefSeq mRNA database，物种是Homo sapiens，其它默认。

把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上.

结果如下图所示：

小贴士

一定要指定一个或几个PCR扩增的目标物种。

在任何时候都要优先使用参考序列的Gi number或Accession number。

如果对某条染色体上的某个区域感兴趣，都要先优化使用Gi number或Accession number，况且在Primer-BLAST可以设置引物设计的参数。

尽量使用没有冗除的数据库（如refseq_rna 或 genome database）。

E N D

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