大肠菌群计数要点解读（GB4789.3

录入时间:2018-5-31 14:44:20 来源：青岛海博生物

大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

直接或间接来自人与温血动物的肠道：包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，其中大肠埃希氏菌属为最典型大肠埃希氏菌。

人与温血动物粪便污染的指示菌：

• 大肠埃希氏菌——粪便近期污染；

• 其他菌属——粪便陈旧污染。

肠道致病菌污染食品的指示菌：

• 与肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）来源相同；在外界生存的时间与主要肠道致病菌一致。

二、修订的主要内容

本标准与GB4789.2-2010相比，主要修改如下：

1、删除了标准的英文名称

2、修改了发布单位名称

2010版本“中华人民共和国卫生部”

2016版本“中华人民共和国国家卫生盒计划生育委员会”和“国家食品药品监督管理总局”

3、前言：

本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。 本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下: ———增加了检验原理; ———修改了适用范围; ———修改了典型菌落的形态描述; ———修改了第二法平板菌落数的选择; ———修改了第二法证实试验; ———修改了第二法平板计数的报告。

三、大肠菌群计数的两种方法

第一法 MPN法

适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

检验原理：MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

第二法 平板计数法

适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

检验原理：大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。

MPN法检验操作

第一步：样品稀释

1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。 3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调节。 4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

第二步：初发酵试验 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

初发酵实验培养基：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）

成分

胰蛋白胨20.0g提供氮源

氯化钠5.0g调节渗透压

乳糖5.0g提供碳源、指示系统

磷酸氢二钾2.75g调节pH

磷酸二氢钾2.75g调节pH

月桂基硫酸钠0.1g抑制革兰氏阳性菌生长

PH值6.8±0.2 25℃

用 法

称取本品35.6克，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15分钟，备用。 第三步：复发酵试验(证实试验) 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

复发酵实验培养基：煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）

成分

蛋白胨10.0g提供氮源

乳糖10.0g提供碳源并作为指示剂

牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200mL抑制革兰阳性菌生长

0.1%煌绿水溶液13.3mL抑制革兰阳性菌和部分阴性菌生长

蒸馏水800ml

pH值 7.2±0.1 25℃

第四步：大肠菌群最可能数(MPN)的报告 按确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN 表,报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN 值。

模式：大肠菌群（MPN/g）