病毒滴度怎么计算？

随着细胞和基因治疗领域不断地将产品推向临床，开发适当的分析工具的需求也变得越来越明显。由于其在病人身上的用途，基因治疗产品必须符合严格的安全准则，这突出了良好的分析方法的重要性。FDA早在2004年为生物制药生产引入了过程分析技术（PAT）倡议，以强调在整个生产过程中进行深入检测的重要性，这超越了传统的过程验证和广泛的最终产品测试方法。该倡议鼓励制药公司研究使用新的分析技术，对关键质量属性进行及时测量，以便在生产过程中更好地理解和控制。

对于细胞和基因治疗，供应链的一个关键方面是用于引入相关基因的载体。最常见的是，源自慢病毒（LV）、腺病毒（AdV）或腺相关病毒（AAV）的病毒载体被用于这些治疗方法。病毒载体由于其高度的复杂性，即使是重组腺病毒相关病毒（rAAV），最小和最不复杂的重组病毒载体类型，其结构也比最复杂的重组蛋白更复杂。开发大规模病毒载体的生产策略，关键是要有准确和可重复的分析工具来监测质量属性，确保安全、高质量、一致和有效的产品。

病毒载体的滴度分析概述

由于病毒载体生物制造的复杂性，制造过程中可能存在差异，因此需要对过程中的产品进行表征，以确保批次间的一致性。基因治疗产品必须符合严格的安全指南，强调充分表征分析的重要性。

➤病毒验证

可以运行测试以确保病毒载体制剂的身份。SDS-PAGE、质谱、免疫印迹和ELISA等测定可用于观察病毒蛋白表达。病毒蛋白的适当数量、分子量和化学计量可用于明确识别载体。相反，可以使用PCR或高通量NGS（下一代基因组测序）评估载体基因组以确保阳性鉴定。

➤物理滴度

物理滴度计算存在的活病毒和死病毒颗粒的总数，并表示为每毫升的病毒颗粒数（VP/mL），对于AAV则表示为每毫升的基因组拷贝数（GC/mL）。rAAV疗法的临床剂量通常基于物理滴度，因此采用准确的质量控制方法来确定被施用的载体量非常重要。有多种方法用于确定基于病毒基因组或病毒蛋白浓度的病毒物理滴度。

历史上，DNA杂交试验被用来量化制剂中存在的病毒基因组的数量。用核酸酶去除样品中的质粒和未包装的载体DNA，因此只有完整的外壳内的病毒基因组才会被检测出来。将载体DNA信号与质粒DNA标准曲线的信号进行比较，并推断出载体基因组滴度。

高效液相色谱法（HPLC）也是一种快速量化总病毒颗粒的方法，因为该色谱柱可以将完整的病毒颗粒与其他细胞污染物或病毒颗粒碎片分开。

最广泛使用的定量包装AAV载体基因组的方法是基于实时PCR的检测方法（即qPCR，数字滴度PCR），因为它们坚固、简单、快速、方便。载体基因组的滴度是通过使用适当的引物和荧光探针来确定的。然而，由于PCR受到许多实验因素的影响，检测中可能存在很大的变异性。这可能会影响滴度的准确性，进而影响临床前和临床环境中的载体剂量。因此，检测设计和纳入适当的标准需要经过深思熟虑。

➤感染性或功能性滴度

感染性或功能性滴度总是比物理滴度更准确，因为它衡量的是有多少病毒可以感染目标细胞。然而，功能滴度通常需要更长的时间才能确定，有时在病毒载体生产的中间生产阶段并不实用。

对于慢病毒或逆转录病毒载体，功能滴度表示为每毫升（TU/mL）的转导单位。腺病毒载体滴度通常表示为每毫升噬菌斑形成单位（PFU/mL）或感染单位每毫升（IFU/mL）。后一个术语用于不裂解细胞膜的病毒载体，因此与噬菌斑测定不兼容。

病毒斑块测定是最广泛使用的确定感染滴度的方法之一。用病毒的连续稀释液转导容许的细胞系，细胞以极低的感染复数（MOI）感染，以确保大多数转导细胞被单个病毒颗粒感染，以进行准确定量。病毒在受感染的细胞中繁殖，最终导致细胞裂解，扩散到邻近的细胞，最终在细胞单层上形成可见的孔洞（或斑块）。特定稀释度下的总菌斑计数提供了每毫升的菌斑形成单位（PFU）数。

终点稀释试验（TCID50）通过量化杀死或在50%宿主细胞中产生细胞病理学效应所需的病毒量来测量感染性病毒滴度。尽管斑块形成测定法和终点稀释测定法都给出了感染性滴度，但它们是由人眼打分的，并受人和程序的影响。

免疫荧光病灶检测法（IFA）也被称为荧光病灶检测法FFA，显示出与斑块检测法的良好相关性，并捕获不裂解细胞膜（与斑块检测法不兼容）或不表现出可检测的细胞病理学效应（进行TCID50）的病毒。IFA利用基于抗体的染色方法来检测病毒感染的细胞。IFA的结果以每毫升病灶形成单位（FFU），或IFU/毫升表示。总的来说，IFA被认为是一种比传统的斑块检测或TCID50更快速和敏感的方法来确定感染性滴度。

病毒载体制造中使用的分析方法概述

总结

基于上述广泛的分析工具清单，可以应用于病毒载体制造的不同阶段。需要强调的是，并非所有的分析方法都适用于产品开发的每个阶段。在产品发布的质量控制测试中常规使用的技术与产品开发过程中扩展表征的技术之间可以进行区分，无论是由于可重复性还是执行检测所需的专业知识/时间差异。

随着细胞和基因治疗领域专注于产品的商业化，制造商和疗法拥有者谨慎地确保所有过程和程序都能满足当前的监管要求。而细胞和基因治疗产品的安全参数仍在不断变化，而且该领域的需求也多种多样。统一分析方法以确保质量属性符合特定应用的验收标准也是非常重要的（这可能因疾病和向患者提供的方法而不同）。

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