水稻亚细胞定位

通过这篇文章，希望对水稻的原生质体大小、亚细胞定位和BiFC等实验有个大概的认识。

听我老师说，万建民院士团队里有个专业制备原生质体并转化拍片的高手，很是羡慕啊，真想向他取取经，如果有读者认识的，请在评论区告诉一下小编啊，好，接下来研读文献。

OsRE1 interacts with OsRIP1 to regulate rice heading date by finely modulating Ehd1 expression

实验方法：

OsRE1和 OsRIP1的CDS 分别与PAN580亚细胞定位载体融合 ，绿色荧光蛋白在N端，采用之前所述(zhang et al. ，2011)方法，将GFP融合质粒被转化水稻原生质体，Pro35s: D53-mcherry 被用作核Marker (zhou et al. ，2013)。用 ZESS LSM880共聚焦显微镜检测荧光信号。

实验结果：

为了确定OsRE1的亚细胞定位，我们在花椰菜花叶病毒 CaMV 35S启动子(35S: OsRE1-GFP)的控制下，用 融合了mCherry的D53作为核Marker (zhou et al. ，2013)。如图3a 所示，OsRE1-GFP 荧光信号与 D53-mCherry 信号融合良好，提示OsRE1是一种核蛋白。

分析：① Bar值加在Merged视野中，因为Merged视野是前三张视野的叠加，最能说明它们的视野大小是一样的，当然也有文献的做法是每张视野都加同样大小的Bar值（BiFC的Bar值也加在Merged视野中）。

②通过Bar值我们大致可以知道这个水稻原生质体的大小约为35 µm，这是比较成功的转化结果，其实水稻的原生质体大小为10~38 µm居多，但大的原生质体比较容易破，而且可能由于新城代谢原因，15 µm左右的原生质体转化表达效果比较好（对于新手来说），故称万建民院士团队有个水稻原生质体提取并转化的高手。

③通过这个结果我们也可以知道，结果可以不需要放空载PAN580(35S: GFP)的定位结果，主要原因可能是有Pro35s: D53-mcherry核Marker的纯在。

但令我意外的是，这篇文章的BiFC实验是在烟草中做的，怎么说呢，烟草表达不是不可以，但烟草对于水稻的研究来说属于异源表达，不如就在水稻原生质体里做的蛋白互作可信度更高。

Overexpression of OsbHLH107, a member of the basic helix-loop-helix transcription factor family, enhances grain size in rice (Oryza sativa L.)

亚细胞定位于BiFC实验方法：

在瞬时表达载体 PAN580-GFP 中（在2 × CaMV35S启动子的控制下），将 OsBHLH107的全长或截短的氨基酸序列与 GFP 融合。水稻原生质体的制备和转化如之前所述(Chen et al., 2006)，OsMADS3 (LOC_Os01g10504)(Li et al., 2011) 和D53 (LOC_Os11g01330) (Zhou et al.,2013)被用作核Marker。在 BiFC检测中，将 OsBHLH107的 CDS 扩增并分别克隆到 p2YN 和p2YC  载体中，分别构建p2YN-OsBHLH107和 p2YC-OsBHLH107质粒，根据之前描述转化烟草叶片（Waadt and Kudla,2008）。用 ZESS LSM880共聚焦显微镜检测荧光信号。

实验结果：

为了验证 OsBHLH107的亚细胞定位模式，我们在水稻原生质体中瞬时表达了 p35S::OsBHLH107-GFP 载体。正如所料，OsBHLH107-GFP 融合蛋白与细胞核Marker(OsMADS3-mCherry) (Li et al., 2011)共定位，表明OsBHLH107在细胞核里行使功能。

分析：① 这里的Bar值加在所有视野中，原生质体大小为38 µm左右。OsMADS3 (LOC_Os01g10504)和D53(LOC_Os11g01330)都可以作为核Marker。

亚细胞定位对于一篇好的文章来说是很必要的，所以还是好好重视才行，下次有机会把自己的操作步骤与大家分享。