Lipofectamine 2000

2024-06-30 05:08| 来源: 网络整理| 查看: 265

快速链接介绍材料与订购信息方案扩大或缩小转染规模相关产品信息 Lipofectamine 试剂Opti-Mem 培养基siRNA 介绍

Invitrogen™ Lipofectamine™ 2000 转染试剂是一种用于将核酸（DNA 和 RNA）转染至真核细胞的具有专利技术的制剂，具有以下优势：

对于许多细胞类型和规格（例如 96 孔）具有较高的转染效率。有关成功转染的细胞类型列表，请参阅细胞系数据库。在存在或不存在血清的情况下，均可将核酸-Lipofectamine 2000 复合物直接添加至培养基中的细胞中。转染后无需去除复合物或更换/添加培养基，不过，4-6 小时后可以去除复合物。

转染指南

使用以下程序，用短干扰 RNA (siRNA) 或 Invitrogen™ Stealth RNAi™ 转染细胞。

使用以下程序，用质粒 DNA 转染细胞。我们建议使用 Gibco™ Opti-MEM™ I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 Lipofectamine 2000 和核酸，然后形成复合物。请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。在实验之间保持相同的接种条件。检测无血清培养基与 Lipofectamine 2000 的兼容性，因为一些无血清制剂（例如，CD293、SFM II、VP-SFM）可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。

注：有关 RNAi 实验的更多提示，请参阅“RNAi 成功的七个步骤”。该手册可从 www.lifetechnologies.com/RNAi 下载或从技术服务部获取，细胞类型特定 RNAi 转染方案也是如此（参见“RNAi 方案”）。

返回顶部11668027,11668019,11668500,31985062 质量控制

用血琼脂平板、沙氏葡萄糖琼脂平板和液体巯基乙酸盐培养基检测 Lipofectamine 2000 是否不存在微生物污染，并通过用报告基因质粒转染 CHO-K1 细胞对其进行功能检测。

返回顶部 Stealth RNAi 或 siRNA 转染

使用此简单程序将 Stealth RNAi 或 siRNA 转染至 24 孔规格板内的哺乳动物细胞中。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。所有用量和体积均按每孔给出。使用此程序作为起点；如“优化 Stealth RNAi 或 siRNA 转染”中所述优化转染，特别是首次转染哺乳动物细胞系时。

转染前一天，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 30-50%。注：在更低密度时进行转染可以让转染和检测之间的时间间隔更长，并且使细胞过量生长造成的细胞活力损失最小。对于每份转染样本，按下列步骤制备低聚体-Lipofectamine 2000 复合物： a. 使用 50 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 20 pmol Stealth RNAi 或 siRNA 低聚体（当添加至细胞中时，RNA 的最终浓度为 33 nM）。轻轻混匀。b. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine 2000，然后取 1 μL 在 50 μL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。注：在 25 分钟内继续进行步骤 c。c. 孵育 5 分钟后，混合稀释的低聚体和稀释的 Lipofectamine 2000。轻轻混匀并在室温下孵育 20 分钟（溶液可能变得浑浊）。

将低聚体-Lipofectamine 2000 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-96 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。培养基可在 4-6 小时后更换。返回顶部优化 Stealth RNAi 或 siRNA 转染

为获得较高的转染效率和较低的非特异性效应，通过改变 RNA 和 Lipofectamine 2000 浓度来优化转染条件。对于 24 孔规格板，检测 10-50 pmol RNA 和 0.5-1.5 µL Lipofectamine 2000。根据靶基因性质，在优化条件时也可考虑以更高密度转染细胞。

返回顶部质粒 DNA 转染

使用以下程序将 DNA 转染至 24 孔规格板内的哺乳动物细胞中。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。所有用量和体积均按每孔给出。对于大多数细胞系，使用 1:2 至 1:3 的 DNA (μg):Lipofectamine 2000 (μL) 比制备复合物。以较高细胞密度转染细胞，从而获得较高效率、较高表达水平，并尽可能降低细胞毒性。可能需要优化（参见“优化质粒 DNA 转染”）。

贴壁细胞：转染前一天，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对 0.5-2 x 105 个细胞进行铺板，使细胞在转染时的汇合度达到 70-90%。悬浮细胞：在即将制备复合物之前，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对 4-8 x 105 个细胞进行铺板。对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物： a. 使用 50 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基（或其他不含血清的培养基）稀释 DNA。轻轻混匀。b. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine 2000，然后取适量在 50 μL Opti-MEM I 培养基中稀释。在室温下孵育 5 分钟。注：在 25 分钟内继续进行步骤 c。c. 孵育 5 分钟后，混合稀释的 DNA 和稀释的 Lipofectamine 2000（总体积 = 100 μL）。轻轻混匀并在室温下孵育 20 分钟（溶液可能变得浑浊）。注：复合物在室温下稳定保存 6 小时。

将 100 μL 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。在进行转基因表达检测前，在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 18-48 小时。培养基可在 4-6 小时后更换。对于稳定细胞系：在转染后 24 小时，以 1:10 的稀释度（或更高稀释度）将细胞传代至新鲜生长培养基中。次日，添加选择性培养基（如需要）。优化质粒 DNA 转染

为获得较高的转染效率和较低的细胞毒性，通过改变细胞密度以及 DNA 和 Lipofectamine 2000 浓度来优化转染条件。确保细胞汇合度大于 90%，并在 1:0.5 至 1:5 的范围内改变 DNA (μg):Lipofectamine 2000 (μL) 比。

返回顶部扩大或缩小转染规模

为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Lipofectamine 2000、核酸、细胞和培养基的用量。对于自动化、高通量系统，在 96 孔板中进行转染时，建议采用 50 µL 的复合体积。注：您可以通过将细胞直接铺板到转染混合物中，进行快速 96 孔板转染。在平板中制备复合物，并向 100 μL 体积中直接添加密度为基础方案中规定的细胞密度的两倍的细胞。在存在复合物的情况下，细胞将照常粘附。

培养容器每孔表面积1共享试剂DNA 转染RNAi 转染铺板培养基体积稀释培养基体积2DNALipofectamine 2000RNALipofectamine 2000 96 孔 0.3 cm 2 100 μL 2 x 25 µL 0.2 µg 0.5 μL 5 pmol 0.25 μL 24 孔 2 cm 2 500 μL 2 x 50 μL 0.8 µg 2.0 μL 20 pmol 1.0 μL 12 孔 4 cm 2 1 mL 2 x 100 μL 1.6 µg 4.0 μL 40 pmol 2.0 μL 6 孔 10 cm 2 2 mL 2 x 250 μL 4.0 µg 10 µL 100 pmol 5 μL 60 mm 20 cm 2 5 mL 2 x 0.5 mL 8.0 µg 20 μL 200 pmol 10 µL 10 cm 60 cm 2 15 mL 2 x 1.5 mL 24 µg 60 μL 600 pmol 30 μL

¹ 表面积可能不同，具体取决于生产商。² DNA 或 RNAi 转染方案的步骤 2a & 2b 中的稀释培养基体积。

返回顶部11668.2k.pps 2006 年 7 月 11 日

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