冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复机制

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)能够引起人类各种各样的疾病，从轻微的皮肤感染到严重的如败血症、中毒性休克、心内膜炎和肺炎等疾病[1]。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性致病菌，能够生长在一个广泛的温度范围从7 ℃到48.5 ℃之间，pH范围在4.0到10.0之间[2]，NaCl浓度小于25%的条件下都能够正常生长[3]，这些特征能够确保金黄色葡萄球菌在广泛的食品环境和胁迫条件下长时间存活下去。

低温被广泛应用于确保食品的质量与安全，但是金黄色葡萄球菌在低温贮藏时能够处于冷冻致亚致死损伤状态[4, 5](菌体细胞受到外界不利环境胁迫如冷冻、高压、干旱、饥饿时，造成自身细胞损伤但并未死亡)，这种受损细胞不易被检出，待食品置于适宜环境下时，亚致死休眠细胞便可修复[6, 7]，为食品安全监测与控制带来很大隐患。Brashears等通过对大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的研究发现，亚致死损伤细胞表现为细胞壁和细胞膜的结构性损伤，进而影响了细胞膜渗透调节能力[8]。Estefania等研究了细胞固定化对热诱导亚致死损伤的大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的影响，发现累积的亚致死损伤能够引起细胞的失活，而亚致死损伤细胞能够在适宜的条件下修复为正常细胞[9]。

目前的研究大多集中在胁迫失活条件下金黄色葡萄球菌的细胞生理变化，但是对于冷冻致亚致死损伤细胞的修复机制还鲜有研究，本文以冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌ATCC6538为研究对象，研究冷冻致亚致死损伤细胞修复过程中细胞活性变化规律，通过透射电镜(TEM)观察细胞超微结构的变化、细胞内外核酸及蛋白质的泄漏情况，细胞中ROS和SOD含量的变化以及相关基因的转录表达水平，从而探讨冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复机制，旨在为食品中冷冻致亚致死损伤致病菌的检测提供理论依据。

金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，来源于美国标准菌种收藏所；添加了酵母浸膏的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA+0.6%YE)，添加了酵母浸膏的胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB+0.6%YE)，购自北京路桥生物公司。

-18 ℃冰箱，上海市美菱有限公司；恒温恒湿培养箱，上海鸿都电子科技有限公司；透射电子显微镜，JEM-1400，日本JEOL公司；紫外可见光分光光度计-722型，上海光谱仪器公司；日本SANYO：3-30K台式高速离心机，Sigma。

从-80 ℃冰箱中取出保藏的金黄色葡萄球菌菌种，在TSA+0.6%YE平板划线培养1 d后获得单菌落，挑取一个单菌落于5 mL的TSB+0.6%YE中，37 ℃、200 r/min摇床培养6 h，使细菌生长到对数期，调整细菌浓度达到大约109-1010 CFU/mL，直接置于-18 ℃冰箱中，冻藏90 d备用。

冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌在TSA+0.6%YE 培养基上能够正常生长，而在添加10% NaCl的高盐度stressingTSA+0.6%YE培养基中不能生长[4, 10]，因此，在这两种培养基上所得或细胞数目的差值为亚致死损伤细胞数目。样品在室温下解冻后置于37 ℃培养箱中，在0、0.5、1.0、2.0和3.0 h分别用这两种培养基计数冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌。

亚致死损伤率通过公式(1)[11]计算。

参照Xie等[12]的方法进行，分别通过离心的方法收集1 mL冷冻90 d和修复1 h的金黄色葡萄球菌细胞，采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，经DnaseⅠ处理后，用反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA。cDNA的Real-time PCR定量测定采用ABI Stepone plus型实时荧光PCR仪进行，扩增程序为：50 ℃ 2min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。本实验所采用的各扩增引物如表1所示，根据各扩增曲线的Ct值，以16S rRNA基因的表达为内参，计算各基因转录表达的相对量，结果用2-ΔΔCt法表示[17]。

将37 ℃修复0、0.5、1.0、2.0、3.0 h的样品于4 ℃、2616×g离心15 min，收集上清液，置于石英比色皿中，使用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值[18]。

分别取-18 ℃贮藏90 d的冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌和1 h修复启动过程中的金黄色葡萄球菌菌液各10 mL，4 ℃、7267×g离心15 min，弃去上清液，将重悬的菌体细胞转移至1.5 mL的离心管中，再次4 ℃、7267×g离心5 min，最后将菌体置于4%戊二醛溶液固定4 h，用0.2 mol/L，pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)漂洗4次，每次10 min，然后用1%的锇酸固定1.5 h，倒掉固定液，用PBS缓冲液漂洗4次，每次10 min，用梯度浓度(30%、50%、70%、90%、100%)的丙酮对样品进行脱水处理，每种浓度处理10 min，再用100%的丙酮处理样品2次，每次45 min，用环氧树脂包埋剂处理样品4 h，最后置于37 ℃、12 h，45 ℃、12 h和60℃、24-48 h聚合。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90 nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液分别染色15 min后，使用透射电镜观察细胞超微结构的变化。

参照文献[19]的方法，分别取-18 ℃贮藏90 d的冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌和修复0.5、1.0、2.0、3.0 h的细菌悬浮在PBS缓冲液中，加入0.5 mL氮蓝四唑(NBT)(1 mg/mL)37 ℃培养30 min，接着添加0.1 mL HCl(0.1 mol/L)在164×g离心10 min。蓝色的悬浮液(ROS胞外组分)在575 nm测定。分离的菌体用0.6 mL DMSO处理去提取减少的NBT，最后加入0.8 mL PBS缓冲液在575 nm下测定胞内活性氧(ROS)。

参照文献[19, 20]的方法，分别取-18 ℃贮藏90 d的冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌和修复0.5、1.0、2.0、3.0 h的细菌，分别4 ℃、16350×g离心15 min，分离菌体(胞内组分)和上清液(胞外组分)。菌体在功率50 W超声1 min后，在pH7.8，含5 mg/mL溶菌酶的PBS缓冲液中37 ℃培养30 min。分别取100 μL胞内和胞外组分，加入13 mmol/L的甲硫氨酸0.5 mL、75 μmol/L NBT 0.5 mL、100 nmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.5 mL、50 mmol/L的PBS缓冲液3.5 mL，最后加入2 μmol/L的核黄素0.5 mL，混匀后将对照管包于双侧锡箔纸中避光，其他各管均于日光灯下反应15 min。反应结束以后，用黑布盖上终止反应。以避光管作为空白调零，以未加酶液的光照管作为对照，在560 nm波长下测定各管吸光度。以抑制NBT光还原反应所需酶量作为酶活性的单位。SOD总活计算公式[20]如下：

SOD活性 [U/(g·Fw·h)]=(A0-As)×Vt×60/(A0×0.5×Fw×Vs×t)

式中A0-照光对照管的光吸收值；As-样品管的光吸收值；Vt-样液的总体积(mL)；Vs-测定时样品用量；Fw-样品鲜重(g)；t-反应时间(min)。

文中数据为3次平行测定的平均值。采用Origin 8.0绘图，显著性分析采用SPSS 18.0的单因素方差分析(One-Way ANOVA，Turkey)，在显著性水平P＜0.05下进行数据分析与统计。

从图1可以看出，通过公式计算得到在-18 ℃贮藏90 d(修复0 h)之后，金黄色葡萄球菌的冷冻致亚致死损伤率达到99%以上，因此我们选择-18 ℃贮藏90 d的冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌做为对照菌株。冷冻致亚致死损伤的细胞在0-1 h修复速度比较快，随后逐渐减慢，3 h后大部分冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌都完成修复。随着细胞的修复，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌的耐盐胁迫能力逐渐增强，我们推测可能是冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌的细胞膜逐渐修复，细胞膜渗透调节能力逐渐增强[7]。

活性氧(ROS)参与了许多重要的生命活动，比如信号转导、细胞凋亡、组织损伤等[20]。从图2-A可以看出，细胞NBT的减少量表明冷冻致亚致死损伤修复过程中细胞内的活性氧的含量远远大于细胞外，细胞内活性氧的含量随着细胞活性的修复而逐渐减少，而胞外活性氧的含量无明显变化(P> 0.05)。本研究结果表明，在冷冻致亚致死损伤修复过程中，细胞活性氧含量的逐渐减少，其所遭受的氧化胁迫也逐渐减弱，细胞活性得以恢复[21]。

在生物体内的SOD功能主要是催化超氧化物的阴离子自由基(O2-)产生歧化反应生成H2O2，而H2O2可再由谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)转化为H2O，SOD能专一地清除超氧阴离子自由基，从而防止O2-对细胞和细胞膜系统造成损伤[22]。从图2-B可以看出，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中，细胞SOD活性表现出逐渐下降的趋势。在冷冻致亚致死损伤修复前细胞内SOD活性为647.3 U/(g·Fw·h)，修复前期SOD活性变化幅度较大，随着修复时间的延长，细胞SOD活性减少的幅度明显降低，说明随着细胞修复的进行，细胞质基质中活性氧的含量逐渐减少，细胞中SOD活性也相应降低。

本实验以金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因表达为内参，研究了冷冻致亚致死损伤的细胞修复过程中，细胞膜相关基因msrR、抗氧化应激相关基因fhuC、产能代谢相关基因cytB的相对表达量。msrR基因编码的MsrR蛋白，属于细胞膜相关蛋白LytR-CpsA-Psr家族的成员之一[23]，该蛋白在细胞中主要参与细胞分裂和隔膜的形成[13, 24]，同时该蛋白还参与金黄色葡萄球菌毒力因子的合成[25]。fhuC基因编码一个ATP结合蛋白，该蛋白主要参与促进宿主细胞对Fe3+离子的吸收，Fe3+与Mn2+构成致病菌抗氧化应激酶(过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等)的辅酶因子[26]，研究发现金黄色葡萄球菌缺失该基因片段后发现高铁离子吸收系统出现损伤[27, 28]。cytB是与能量代谢相关的细胞色素类遗传因子，作为氧化还原和能量代谢的媒介来实现细胞内能量供给的偶联反应[29, 30]。

如图3所示，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复启动1 h后，msrR和fhuC基因表达量分别显著下调2.11和1.46倍，而cytB基因表达量显著上调3.93倍。msrR基因作为膜蛋白调控基因的一员表达量下调，可能与亚致死损伤细胞膜对 冷冻胁迫的耐受性减弱有关[13]，说明冷冻对金黄色葡萄球菌的损伤作用主要在于细胞结构的破坏，细胞通过调节膜相关基因的表达而达到对这种破坏的耐受性，即可长期抵御冷冻胁迫，而在修复启动过程中该基因的表达量下降，这可能与细胞膜的修复有关。亚致死损伤修复过程中抗氧化应激相关基因fhuC表达量下调促进了细胞中ROS的减少，有助于降低修复后ROS对细胞的毒害作用。亚致死损伤修复过程中产能代谢相关基因cytB表达量显著上调，表明在细胞修复过程中细胞的耗能在逐渐增加，细胞从休眠状态逐渐恢复到正常状态，需要大量的能量供应。因此，在这些相关基因的调节作用下，冷冻致亚致死损伤的细胞活性逐渐恢复。

冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中细胞超微结构的变化如图4所示，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌细胞呈球形，表面光滑、透明，细胞壁膜出现破损同时伴有细胞内的物质出现泄露(图4-A，C)，而修复1 h后虽然细胞形态变化不明显，但细胞表面变得粗糙、模糊，同时细胞壁膜的破损和泄露明显减少(图4-B，D)[31, 32]。致病菌细胞遭受冷冻致亚致死损伤时，细胞内的自由水形成冰晶，导致细胞光滑、透明，但是细胞膜的完整性遭到破坏，部分出现缺口，出现细胞内物质的泄漏，而在适宜条件下细胞修复过程中，冰晶融化，细胞膜逐渐修复，说明冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中细胞膜的修复是非常重要的环节。

由于致病菌细胞组成中含有嘌呤、嘧啶碱基，蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环，这些结构都具有共轭双键，所以在紫外区有强烈的光吸收作用，核酸和蛋白质的最大吸收峰分别在260 nm和280 nm附近[33]。因此可以通过测定260 nm和280 nm处的紫外吸收强度来确定细胞内核酸和蛋白质物质的泄露情况。

从图5中可以看出，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中，细胞外液中核酸(OD260)、蛋白质(OD280)两种物质的含量随时间的延长逐渐增加，尤其是在0-1 h内核酸和蛋白泄露速度较快，而随后细胞内紫外物质泄漏速度逐渐变慢并趋于稳定。已知冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌的细胞膜受到严重损伤，因而在修复前期细胞内核酸和蛋白质的泄露量较大，而随着修复时间的增加，细胞内的核酸和蛋白质的泄漏速度明显变慢，可能与细胞膜的修复有重要的联系，这也与细胞膜超微结构的研究结果相一致(图4)。

本文以修复过程中的冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌为研究对象，采用Real-time PCR方法测定了细胞膜相关基因msrR、抗氧化应激相关基因fhuC和产能代谢相关基因cytB表达量变化，并测定了细菌超微结构、细胞膜的完整性、细胞ROS含量、SOD活性以及紫外吸收物质泄漏量等生理指标，从而探讨了冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复机制。(1)冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌在适宜的条件下是可以在短时间内得到修复的。(2)冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复启动过程中细胞膜相关基因msrR和抗氧化应激相关基因fhuC表达量显著下调，而产能代谢相关基因cytB表达量显著上调。(3)冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌细胞表面出现缺口，细胞膜完整性被破坏，修复过程中细胞的超微结构逐渐恢复，因而细胞耐盐胁迫能力也逐渐回复为正常状态。(4)金黄色葡萄球菌修复过程中细胞内的核酸、蛋白质等物质流出，随着修复过程的进行，细胞膜完整性得以恢复，细胞内物质泄漏速度逐渐减慢。(5)细胞修复过程中细胞中的ROS含量和SOD活性逐渐降低，说明细胞在修复过程中降低了活性氧的毒害作用，有利于细胞的正常生长。

综上所述，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌的修复可能与细胞表面的修复、细胞中活性氧含量降低以及产能代谢活动逐渐增强有关，随着细胞膜的逐渐修复，细胞的耐盐胁迫能力逐渐增强，对维持细胞内外渗透压的稳定性起到非常重要的作用。细胞内超氧阴离子逐渐减少，降低了对细胞的毒害作用，同时细胞的产能代谢逐渐增强，有助于为细胞活动加强提供足够的能量。然而，冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复机制是一个复杂的过程，可能包含多个相关基因表达的参与。因此，该机制有待从分子水平上做进一步的深入研究。