检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用

背景技术：

2.（一）牡丹黄斑病现有诊断技术2.1 黄斑病已成为牡丹产业发展的制约因素之一牡丹不仅因其花大而香、花色艳丽而具有极高的观赏价值，而且根部含有抗菌消炎物质——丹皮酚，籽粒中含有42%以上的α-亚麻酸、92%以上的不饱和脂肪酸等数十种营养成分，使牡丹同时具有很高的药用和食用价值。发展好牡丹籽油产业，对于破解我国食用油对外依存度过高的困局、保障我国食用油安全和人民群众身体健康等都具有重要意义。牡丹耐旱耐贫瘠，适合荒山绿化造林、林下种植，在我国与文冠果等木本油料作物套种，经济收益明显，会发挥越来越重要的作用。3.随着连作时间的延长，有害生物对牡丹种植带来越来越严重的威胁。其中，尤以牡丹叶部病害对牡丹生产的威胁最为严重。由斑点叶点霉（phyllosticta commonsii）引起的黄斑病是发生最为普遍的牡丹叶部病害之一：初期病斑为圆形或近圆形，黄褐色或黄白色，稍凹陷，病斑大小3～5mm；后期病斑逐渐连接成片，病斑黄色至褐色，不形成穿孔，空气潮湿时病斑上散生小黑点，为病菌的分生孢子器。斑点叶点霉主要以菌丝体或分生孢子器在发病组织及其残枝落叶上越冬，在来年春天产生分生孢子，可以通过风和雨传播，牡丹的下部叶片先发病，阴雨潮湿的环境会加重黄斑病的发生和病原菌的再侵染。黄斑病发病初期的症状和叶霉病、黑斑病、灰霉病等多种其它叶部病害很难区分，往往在病害中后期才容易分辨。这造成了生产中牡丹种植园即使采取相应的防治措施，但防治时期滞后，而发病后期对病害的防治效果已不明显。由于病菌对药剂的敏感性不同，如果在发病晚期对黄斑病喷药防治，不仅会增加生产成本，造成药液浪费并污染环境，而且还起不到防治病害的效果。因此，为了及时控制牡丹黄斑病害的发生，在发病初期进行牡丹黄斑病菌的早期诊断就显得至关重要。4.2.2 黄斑病早期诊断的传统技术由于发病早期，斑点叶点霉在牡丹叶片表面尚不能形成典型病征，且此时病状和其它叶部病害很难区分，故此时对黄斑病诊断不能采用病征刮、挑或徒手切片的方法，而只能采用病菌分离、纯培养后制片镜检，必要时结合基因序列分析的方法。5.斑点叶点霉传统的组织分离法操作步骤如下：1 物品准备：实验室内准备马铃薯蔗糖琼脂培养基（psa），准备灭菌的培养皿、无菌水等物品，所需器材包括：必备物品有灭菌锅、超净工作台、培养箱、显微镜、挑针等；选备物品有pcr仪、凝胶电泳系统，移液器，pcr管、离心管，taqdna聚合酶、dntp混合物、液氮等（如果病菌不产孢，就需进行分子鉴定）；2 病菌分离：挑取单个发病病斑，从病健交界处切下大小4～5 mm的组织块，用75%酒精消毒20s左右，再用3%的naclo溶液消毒3min，最后用无菌水漂洗3次，滤纸吸干水后转入含有乳酸的psa培养基上，每皿4～5块，26℃倒置培养5天，待病组织小块上长出同心轮纹无杂菌的真菌菌落时，用接种针挑取菌落边缘小块至斜面培养基上，培养3～4天，得到纯菌种，便可置于冰箱中保存。对菌落形态观察，看是否与斑点叶点霉菌落形态相符；3 形态学鉴定：从菌落中挑取少许培养物，置于显微镜下，低倍镜下观察，后转到高倍镜，看是否有斑点叶点霉的孢子、分生孢子器等典型结构；4 如果显微镜下观察不到孢子，则需通过ctab法提取病菌的基因组dna，依据通用引物，对病菌的rdna-its序列进行扩增，扩增后送到生物公司测序；得到序列后在基因组数据库上比对，看是否为斑点叶点霉。6.黄斑病早期诊断的流程图如图1所示。7.后期，为了简化病菌的分离，课题组依据斑点叶点霉和其它常见污染菌对药剂的敏感性不同，通过向基础培养基（psa）中添加多菌灵、乙膦铝及代森锰锌等抑菌物质，筛选到了一种专一分离斑点叶点霉的选择性培养基。尽管简化了病菌分离的操作步骤，但后面的病菌鉴定仍无法改变。（参考文献：徐建强, 秦玉佳, 张馨, 刘哲然, 李鹏飞, 夏彦飞, 郑伟, 侯颖. 一种快速分离牡丹黄斑病病原菌的选择性培养基. 农药学学报, 2020, 22(3): 550-555.）。8.（二）本发明技术背景环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）技术由日本科学家notomi等发明并首次报道，它能够在等温（60-65 ℃）条件下利用链置换bst dna聚合酶和特异性引物短时间（通常《1 h）内大量扩增核酸片段。该技术具有快速高效、费用较低、灵敏度高、特异性强以及产物检测方便等特点，因此受到各国研究学者们的广泛关注，目前已被广泛应用于临床诊断、食品安全、动物疫病检测、植物病原物检测及环境监测等领域，具有广泛的发展应用前景。在植物病原菌检测方面，可用于检测植物病原真菌、细菌、病毒和线虫等。lamp产物的检测可通过在反应体系中添加dna嵌合染料sybr green i或金属离子指示剂羟基萘酚蓝（hnb）和钙黄绿素后产生的颜色变化通过肉眼观察来判断；也可以将产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，看是否形成典型的梯形条带来进行。但dna嵌合染料sybr green i是在反应完成后添加的，会增加产物污染的机会，造成假阳性。为了避免此类污染，可在扩增前向反应体系中添加hnb染色剂，lamp反应扩增完成后，产应液的阳性产物为天蓝色，而阴性产物仍保持紫色。颜色的变化通过2.0%琼脂糖凝胶电泳再次验证（即用2.0%的琼脂糖凝胶电泳时，阳性扩增形成产生典型的梯形条带，但阴性产物则不形成）。9.（三）植物病害早期诊断在植物病害综合防控中的重要性“预防为主、综合防治”是我国植物保护工作的基本方针。对植物病害的防治，早发现、早治疗比事后喷药防治要有效得多。这要求生产中能有一种对植物某一病害早期诊断的方法。但现在的植物病害诊断，往往都是依据病菌在发病部位形成的病征，镜检后再进行分子序列比对后做出判断，所需时间较长，而对于病原生物引起的流行性病害，从早期病斑到大范围流行，所需时间很短，所以现在的植物病害诊断方法，无法满足早期诊断的要求。10.病害发生早期，病斑相似，单纯从病状上很难区分；牡丹黄斑病发病早期，在叶片上形成圆形斑点，而叶霉病、炭疽病、灰霉病、黑斑病等都是如此，所以早期很难判断。由于不同病菌对药剂的敏感性不同，对病害的早期诊断还有利于指导生产中的用药选择。只有实现了对病害早期的快速、正确诊断，才能依据病菌种类的不同来选择合适的药剂，从而做到早发现、早确诊、早防治。11.对牡丹黄斑病诊断现有技术存在的缺陷以及原因进行分析：（一）牡丹黄斑病诊断现有技术牡丹黄斑病的现有诊断技术，需对田间疑似病叶进行症状观察、组织分离、纯化培养之后再通过查阅相关资料进行形态学鉴定，需要观察病菌的产孢结构和分生孢子形态；由于发病初期病菌在发病部位尚未形成病征，若进行黄斑病的早期诊断，还需要对病菌进行基因组dna的提取、特异性序列扩增、测序及序列比对等工作，才能判断病菌归属。传统的组织分离结合形态学特征及基因序列的植物病害诊断方法，尽管可以实现对牡丹黄斑病的早期诊断，但存在以下不足之处。12.1 所需时间较长——费时：一般每个病叶需要处理15min左右才能将分离材料进行培养；培养1周后发病组织才能形成病菌的菌落；如果菌落上不产孢，就需要对病菌进行液体培养提取dna，pcr扩增后进行凝胶电泳，测序后进行序列比对，又需要大概20天时间。整个流程约需要7~30d的时间；而对于黄斑病这类流行性病害，如果不能进行早期诊断并及早防治，后期流行起来，防治起来难度会非常大。13.2 操作繁琐——费力：传统的依据病菌形态特征进行的诊断，不仅要求对病菌进行组织分离，而且还要求对病菌进行形态学特征观察和鉴定，步骤较多，操作繁琐，费力。由于在组织分离时一个病叶处理下来要经过叶片分段再切块、多次消毒、清水冲洗及滤纸吸干等四步，样品处理较为麻烦；而对培养出的病菌进行镜检时，常常无法观察到病菌典型的产孢结构及孢子形态，会出现无法判断的结果；如果不产孢，后续的分子鉴定，需要进行病菌dna的提取及pcr扩展和凝胶电泳分析，都较大费周章。14.3 无菌操作要求严格：组织分离法要求必须将试验材料带回实验室，在超净工作台上进行分离，对于野外调查，根本无法进行。而进行非本地的野外调查，很有必要对试材进行及时处理，因为病组织标本新鲜，分离成功率高。很显然，组织分离法无法满足此要求。15.4 所需试剂、耗材较多：组织分离法进行消毒、清洗时，以及病菌培养时，都需要较多的培养皿，以及酒精及naclo等试剂；病菌镜检时，需要载玻片、盖玻片、挑针等耗材；病菌分子鉴定时，需要离心管等。操作下来，需要较多的试剂和耗材。16.5 所需仪器设备多：在病菌组织分离培养时，需要灭菌锅、超净工作台、生化培养箱、微波炉、电磁炉等；在对病菌进行形态特征观察时需要显微镜；如果要进行分子鉴定，则需要更昂贵的pcr仪及凝胶电泳和成像设备。所有设备加起来，费用不菲。17.6 对检测人员要求较高，需要专业的检测人员。组织分离法要求操作者具有无菌操作技能，否则容易受到其它杂菌污染；另外，对消毒时间的把握也很关键，不可过长或过短，过长病菌菌丝易被杀死，而过短消毒不彻底易产生杂菌。即使采用课题组开发的选择性培养基来进行病菌分离，后续的病菌镜检，不仅对无菌操作有一定要求，同时还要具备一定的微生物学知识。而分子鉴定，对操作人员的要求更高，更需要一定的分子生物学操作技能。上述这些都需要掌握一定植物病理学和分子生物学技能的专业技术人员来完成。18.由于传统的组织分离法结合形态学特征观察及分子序列比对的诊断方法，存在着费时、费力、无菌操作要求严格、所需试剂及耗材多、需要的仪器设备昂贵，并且还需要专门的技术人员，带来了诊断效率不高、易受人为因素影响且在生产中难以推广应用等不足之处，不能满足病害早期诊断的要求，有必要开发一种牡丹黄斑病简便、快速的早期诊断技术。19.（二）现有技术不足之处原因分析以病菌组织分离、形态特征鉴定及序列分析相结合的牡丹黄斑病的早期诊断技术，其不足之处的原因主要是因为：牡丹属于小众作物，未能引起科研工作者的足够重视。长期以来，尽管牡丹的观赏及药用价值为大家所熟知，近几年，牡丹的食用价值开始走进人民的视野，但不可否认，和小麦、玉米、水稻等粮食作物，以及番茄、黄瓜、苹果、梨等果蔬相比，由于其经济价值不高（和粮食作物及果蔬等比较）、种植面积较小，并未引起科研工作者的足够重视；而对于牡丹的病虫害，则更位于“冷宫中的冷宫”，研究者屈指可数。牡丹病害的诊断、防控等全是参照其它农作物病害的方法，很少有新方法、新技术应用。不像小麦赤霉病、番茄灰霉病、油菜菌核病等发生普遍、危害严重、对社会经济生活危害大的病害，新技术在病害研究中应用很多，并取得了一系列成果，反过来更促使了病害研究的深度。

技术实现要素：

20.植物病害诊断，传统的方法是依据病原菌的结构特征，尤其是孢子形态，来进行形态学鉴定。操作时要求在发病部位有病征，即病菌的孢子或菌丝等结构，然后挑取或刮取病征进行镜检。而如果发病部位无病菌的产孢结构，则需要进行病原菌的分离，获得纯培养后对菌落中的菌丝、孢子进行鉴定，确认病菌归属，从而反推植物上生了什么病。依据病菌的孢子形态进行的植物病害诊断，所需试剂、耗材较多，存在着既耗时又操作繁琐等问题；更为关键的是：有些病菌在发病部位以及在培养基上不形成病征，即使获得纯培养后还需要做进一步的分子扩增及测序等工作，才能准备判断病原菌种类。鉴于此，本发明基于牡丹黄斑病菌（病原菌：斑点叶点霉phyllosticta commonsii）核糖体dna上的保守区域——内转录间隔区its（internal transcribed spacer，its）设计dna体外扩增引物，通过体外扩增后的颜色反应及电泳条带，建立了一种简便快速检测斑点叶点霉的方法，并将建立的检测体系在洛阳市各牡丹园黄斑病早期诊断上进行了应用。21.本发明解决了现在牡丹黄斑病早期诊断时依据病菌形态学特征、结合分子序列鉴定所存在的一些技术问题，如既耗时又操作繁琐且检测效率低；所需试剂及耗材多、需要的仪器设备昂贵，检测成本较高；无菌操作要求严格，且需要专门的技术人员，难以在生产中推广应用。22.本发明采用的具体方案为：本发明的第一方面，是提供检测牡丹黄斑病菌的lamp引物组，所述lamp引物组包含外引物2-f3和2-b3以及内引物2-fip和2-bip；所述外引物和内引物的核苷酸序列分别为：2-f3：gcctgttcgagcgtcatt；2-b3：agttcagcgggtatccct；2-fip：cgccggctgccaattgttttgtggtgttgggtgtttgtctc；2-bip：gcgcagtacatctcgcgcttcctgatccgaggtcaagagt。23.本发明的第二方面，是提供一种检测牡丹黄斑病菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述的lamp引物组。24.本发明的第三方面，是提供上述lamp引物组或试剂盒在牡丹黄斑病早期诊断中的应用。25.本发明的第四方面，是提供一种检测牡丹黄斑病菌的方法，包括以下步骤：步骤一、提取待测样品总dna；步骤二、以步骤一所得dna为模板，采用上述lamp引物组进行扩增反应；步骤三、根据步骤二的扩增反应结果判定是否含有牡丹黄斑病菌。26.作为对上述方法的进一步优化，步骤一中，采用简易法提取待测样品总dna，所述简易法包括以下步骤：采集作为待测样品的疑似牡丹黄斑病病叶，剪取30-50个病斑于离心管中，加200μl的ddh2o，置于65℃条件下水浴5-10min，离心取上清液作为模板dna。更进一步地，优选40个病斑。27.作为对上述方法的进一步优化，步骤二的反应体系中各试剂的终浓度如下：bst 3.0 dna polymerase 0.32 u/μl、10×thermopol buffer 2.5 μl、dntp 1.0mmol/l、mg2+6 mmol/l、2-f3和2-b3各0.2 μmol/l、2-fip和2-bip各1.6 μmmol/l、hnb 0.15 mmol/l、甜菜碱 1 mol/l、模板dna 1 μl、加ddh2o补至25 μl。28.作为对上述方法的进一步优化，步骤三种，根据步骤二的扩增反应结果判定是否含有牡丹黄斑病菌的方法为：将lamp扩增产物通过hnb可视化和2.0%琼脂糖凝胶电泳检验，若lamp产物由紫色变为天蓝色，且电泳图谱有典型的梯形条带产生，则检测样品为阳性，反之则为阴性。29.本发明建立的牡丹黄斑病菌的lamp检测技术，与现有技术相比具有快速高效、费用较低、灵敏度高、特异性强以及产物检测方便等特点：1、快速高效：lamp检测在等温（60-65 ℃）条件下利用链置换bst dna聚合酶和特异性引物短时间（通常《1 h）内大量扩增核酸片段，大大缩短了反应时间；2、费用较低：lamp检测不需要昂贵的仪器，只需要一个常规的可以提供65℃的恒温水浴锅即可进行；3、灵敏度高：lamp检测的灵敏度是普通pcr的100倍；4、特异性强：本发明建立的牡丹黄斑病菌的lamp检测技术仅能使牡丹黄斑病菌dna产生阳性扩增反应，而其他供试菌株无此类现象；5、产物检测方便：lamp产物的检测可通过在反应体系中添加dna嵌合染料sybr green i或金属离子指示剂羟基萘酚蓝（hnb）和钙黄绿素等肉眼观察是否发生显色反应；或者将产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，看是否形成典型的梯形条带来判断。不需进行繁琐的分离、镜检及分子检测。附图说明30.图1 牡丹黄斑病现在的早期诊断流程图。31.图2 是lamp引物特异性检测结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-3：分别为引物组1、2和3的扩增结果；4：阴性对照（ddh2o）。32.图3是bst 3.0 dna聚合酶浓度的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：bst 3.0 dna聚合酶浓度分别为0.08、0.16、0.24、0.32和0.40 u/μl；6：ddh2o。33.图4 是hnb浓度的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：分别为0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mmol/l；6：ddh2o。34.图5 dntp浓度的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：分别为0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/l；6：ddh2o。35.图6是mg2+浓度的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：分别为4、6、8、10和12 mmol/l；6：ddh2o。36.图7 甜菜碱浓度的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/l；6：ddh2o。37.图8 lamp特异性检测结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-6：分别为牡丹黄斑病菌、叶霉病菌、黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、灰霉病菌和炭疽病菌的dna；7：ddh2o。38.图9 lamp灵敏度检测结果图；其中，a：lamp灵敏度检测的hnb可视化图；b：lamp灵敏度检测的2.0%琼脂糖凝胶电泳图；c：普通pcr灵敏度检测的1.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-8：dna模板浓度分别为100 ng/μl、10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl的扩增结果；9：ddh2o。39.图10 简易法提取dna的lamp检测结果图；图中，m：dl2000 dna marker；1-6：分别为牡丹黄斑病菌、叶霉病菌、黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、灰霉病菌和炭疽病菌的dna；7：ddh2o。40.图11是田间疑似牡丹黄斑病叶的lamp检测结果图；其中，a：a为田间疑似牡丹黄斑病病叶、b为分离的菌落正面、c为菌落背面；d为分生孢子形态图；b：hnb可视化图；c：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-3：基因组dna；4-6：田间病斑dna；7-9：健康叶片对照；10：ddh2o。41.图12 牡丹黄斑病斑数量的优化结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-6：分别为1、10、20、30、40和50个；7：基因组dna；8：ddh2o。42.图13 洛阳市国家牡丹园lamp的实用性检测结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：田间病斑dna；6：基因组dna；7：ddh2o。43.图14是河南科技大学牡丹园lamp的实用性检测结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：田间病斑dna；6：基因组dna；7：ddh2o。44.图15 洛阳市国际牡丹园lamp的实用性检测结果图；其中，a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：dl2000 dna marker；1-5：田间病斑dna；6：基因组dna；7：ddh2o。45.图16 洛阳市中国国花园lamp的实用性检测tu ; 注：a：hnb可视化图；b：2.0%琼脂糖凝胶电泳图；m：dl2000 dna marker；1-5：田间病斑dna；6：基因组dna；7：ddh2o。46.图17是lamp对牡丹黄斑病的早期诊断流程图。具体实施方式47.常规的植物病原菌检测方法无法及时、快速和准确地判定其病原。因此，本研究基于环介导等温扩增（lamp）技术，建立了一种可以快速检测牡丹黄斑病菌的方法。首先以牡丹黄斑病菌its序列的特异性片段为靶标，设计了3套lamp引物，然后从中筛选出最佳的特异性lamp引物，之后优化并建立lamp反应体系，进行lamp的特异性和敏感性检测。其次，摸索从发病组织中提取病菌dna的简化操作方法。最后对该技术在田间应用的效果进行评估。这是lamp技术在牡丹黄斑病菌检测中的首次应用。48.、菌株活化与培养从实验室分离保存的菌株中，每种病原菌各随机挑选3株进行活化，挑取菌丝接在psa平板的中央，置于25 ℃恒温培养箱中倒置培养。待菌落长满平板后，即可进行基因组总dna的提取。49.本实验所用菌株，即黄斑病菌、叶霉、黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、灰霉和炭疽病菌，均已公开，详见表1。所有菌株均由课题组石蜡油保存。使用时，无菌水清洗三遍后，无菌滤纸吸干，置于psa平板上活化。50.表1 本发明涉及的菌株公开信息2、基因组dna的提取本试验采用ctab法提取供试菌株基因组总dna，然后加适量te缓冲溶液（tris-edta buffer solution）溶解沉淀，使用紫外分光光度计将dna浓度调整至100 ng/μl，并储存在-20 ℃的冰箱中备用。51.、牡丹黄斑病菌its测序由于在genebank中未查找到斑点叶点霉（p.commonsii）的基因序列。因此，本研究采用通用引物its1和its4对提取到的牡丹黄斑病菌dna进行普通pcr扩增，将产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳确认无误后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。52.、lamp引物设计将牡丹黄斑病菌的its序列与其他5种牡丹叶片常见病原真菌（叶霉、黑斑病菌、腔孢叶斑病菌、灰霉和炭疽病菌）的its序列做比对，寻找黄斑病菌的特异性片段；以黄斑病菌的特异性片段为靶标，用在线软件primer explorer v5设计了lamp引物。根据引物设计原则，从所推荐的引物中，择优挑选出3套引物。每套引物都包含外引物f3和b3，内引物fip和bip，lamp引物信息详见表2。53.表2 本发明lamp反应的引物信息5、lamp引物的特异性检测lamp反应体系的总体积设为25 μl，各反应液浓度和初始用量分别为：bst 3.0 dna聚合酶（8 u/μl）1 μl；10×thermopol buffer 2.5 μl；dntp（10 mmol/l）3.5 μl；mg2+（100 mmol/l）1.5 μl；甜菜碱（5 mol/l）5 μl；hnb（2.5 mmol/l）2 μl；f3和b3（10 μmol/l）均为 0.5 μl；fip和bip（40 μmol/l）均为1 μl；模板dna（100 ng/μl）1 μl；加ddh2o补至25 μl。反应条件为：65 ℃水浴60 min。54.本试验在反应体系中是添加hnb作指示剂，水浴之前反应体系均为紫色；65 ℃水浴60 min后，若牡丹黄斑病菌的dna序列发生扩增，则lamp产物由紫色变为天蓝色；然后用2.0%琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，若电泳图谱有典型的梯形条带产生，则说明其发生了阳性扩增，检测样品为阳性，反之则为阴性。试验重复3次。验证所设计的3套引物的特异性，并从中筛选出最优特异性引物进行后续试验。55.使用设计的3套lamp引物和初始反应体系，以牡丹黄斑病菌的基因组dna为模板进行lamp，扩增结果通过hnb可视化和2.0%琼脂糖凝胶电泳检验。图2所示，3套lamp引物均可使牡丹黄斑病菌的基因组dna特异性扩增，颜色显示为天蓝色，电泳图有梯状条带产生。因此，本研究设计筛选的3套lamp引物均可特异性检测牡丹黄斑病菌。后续试验均采用最优特异性引物2进行。56.、lamp反应体系的优化与建立根据上述初反应体系，使用最优特异性引物，通过控制单一变量法对lamp反应体系中的bst 3.0 dna聚合酶、hnb、dntp、mg2+和甜菜碱的浓度分别进行优化，以建立最适反应体系进行后续试验。试验重复3次。57.①bst 3.0 dna聚合酶浓度的优化设置lamp反应体系中bst 3.0 dna聚合酶的终浓度分别为0.08、0.16、0.24、0.32和0.40 u/μl，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，从中筛选出最适的bst 3.0 dna聚合酶浓度。58.由图3a可知，bst 3.0 dna聚合酶的终浓度在0.08至0.4 u/μl的5个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色；由图3b可知，电泳图均有典型的梯形条带产生，且终浓度为0.32 u/μl时，梯形条带最为显著。因此，lamp反应体系中bst 3.0 dna聚合酶的最适终浓度为0.32 u/μl。59.②hnb浓度的优化设置lamp反应体系中hnb的终浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mmol/l，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，从中筛选出最适的hnb浓度。60.由图4a可知，hnb的终浓度在0.05至0.25 mmol/l的5个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色，且颜色逐渐加深；由图4b可知，电泳图中均有典型的梯形条带产生，且终浓度为0.15 mmol/l时，梯形条带最为显著。因此，lamp反应体系中hnb的最适终浓度为0.15 mmol/l。61.③dntp浓度的优化设置lamp反应体系中dntp的终浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/l，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，从中筛选出最适的dntp浓度。62.由图5a可知，dntp的终浓度在0.6~1.4 mmol/l的5个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色；由图5b可知，电泳图中均有典型的梯形条带产生，且dntp的终浓度为1.0 mmol/l时，梯形条带最为显著。因此，lamp反应体系中dntp的最适终浓度为1 mmol/l。63.④mg2+浓度的优化设置lamp反应体系中mg2+的终浓度分别为4、6、8、10和12 mmol/l，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，从中筛选出最适的mg2+浓度。64.由图6a可知，mg2+的终浓度在4~8 mmol/l的3个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色，且颜色逐渐加深；由图6b可知，电泳图中这3个浓度梯度均有典型的梯形条带产生，且终浓度为8 mmol/l时，梯形条带最为显著。因此，lamp反应体系中mg2+的最适终浓度为8 mmol/l。65.⑤甜菜碱浓度的优化设置lamp反应体系中甜菜碱的终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/l，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，从中筛选出最适的甜菜碱浓度。66.由图7a可知，甜菜碱的终浓度在0.4~1.2 mol/l的5个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色；由图7b可知，电泳图中这5个浓度梯度均有典型的梯形条带产生，且终浓度为1 mol/l时，梯形条带最为显著。因此，lamp反应体系中甜菜碱的最适终浓度为1 mol/l。67.⑥lamp反应体系的建立根据上述优化结果可知，该反应体系中各式试剂的最适终浓度分别为：bst 3.0 dna polymerase 0.32 u/μl、10×thermopol buffer 2.5 μl、dntp 1.0mmol/l、mg2+6 mmol/l、f3和b3各0.2 μmol/l、fip和bip各1.6 μmmol/l、hnb 0.15 mmol/l、甜菜碱 1 mol/l、模板dna 1 μl、加ddh2o补至25 μl。68.、lamp的特异性检测分别以6种供试菌株的菌丝体总dna为模板，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，按照已优化的最适反应体系进行lamp检测。肉眼观察lamp产物是否由紫色变为天蓝色，然后将产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，看是否形成典型的梯形条带。试验重复3次。69.以6种供试菌株的菌丝体总dna为模板进行lamp时，由图8a可知，仅牡丹黄斑病菌的dna产生阳性扩增反应，其反应体系的颜色由紫色变为天蓝色，而其他样品仍为紫色；由图8b可知，电泳图中仅牡丹黄斑病菌的扩增产物有梯形条带产生，而其他供试菌株电泳检测无条带。因此，本研究建立的lamp体系可特异性检测牡丹黄斑病菌。70.、lamp灵敏度检测将牡丹黄斑病菌的dna以10倍的浓度连续稀释，以获得100 ng/μl、10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl的dna稀释液，并将其用作lamp和普通pcr的模板。使用优化后的反应体系进行lamp检测，使用引物its1和its4进行普通pcr。反应结束后，通过hnb可视化颜色变化和2.0%琼脂糖凝胶电泳确定lamp所能检测到的dna最小浓度；用1.0%琼脂糖凝胶电泳确定pcr所能检测到的dna最小浓度，以确定lamp检测和pcr检测的最大检测限。试验重复3次。71.分别以牡丹黄斑病菌100 ng/μl、10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl的dna稀释液为模板进行lamp，由图9a可知，dna浓度在100 ng/μl至100 fg/μl的7个浓度梯度下，反应液颜色均变为天蓝色；由图9b可知，这7个浓度梯度下的lamp产物均有典型的梯形条带产生。因此，lamp检测牡丹黄斑病菌dna的最大检测限为100 fg/μl。使用通用引物its1和its4进行普通pcr，由图9c可知，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检验普通pcr扩增结果，dna浓度在100 ng/μl至10 pg/μl的5个浓度梯度下，牡丹黄斑病菌的dna均可得到有效扩增。因此，普通pcr检测牡丹黄斑病菌dna的最大检测限为10 pg/μl。综上所述，本研究建立的牡丹黄斑病菌的lamp检测方法的灵敏度是普通pcr的100倍。72.、lapm操作步骤的简化——简易法提取dna由于用ctab法提取菌丝体总dna耗时耗力，且操作较为繁琐。因此，在本试验中我们将提取菌丝体总dna进行了简化，即直接挑取psa平板上的病菌菌丝及孢子于2 ml离心管中，加200 μl ddh2o后置于65 ℃水浴锅中水浴5-10 min，然后放入离心机中10000 rpm离心10 min，最后取上清液做为模板dna，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，进行lamp检测。通过hnb可视化和2.0%琼脂糖凝胶电泳验证此简化方法是否可行。试验重复3次。73.由图10可以看出，简便法提取dna后进行lamp检测，仅黄斑病菌的培养物呈阳性，其余五种病菌均呈阴性，证明简便法提取dna可以在lamp检测中得到应用。74.、lamp在田间检测牡丹黄斑病的应用为了评估lamp检测在田间应用的可行性，从河南科技大学牡丹园中采集疑似牡丹黄斑病病样100份，在实验室条件下剪取病斑进行组织分离、纯化及镜检，并采用65 ℃水浴加热法直接从发病病斑处提取dna。同时取实验室保存的牡丹黄斑病菌基因组dna和健康叶片水浴处理的上清液为对照，以ddh2o取代模板dna设为阴性对照，进行lamp检测。从田间疑似牡丹黄斑病病叶中分离病菌，由图11a可知，病菌在psa平板上菌丝颜色为白色，菌落中央为褐色；镜检分生孢子为椭圆形。通过查阅文献，断定其为牡丹黄斑病菌。75.对田间100份病叶进行lamp检测，结果均呈阳性，部分结果展示如下。由图11b和图11c可知，基因组dna和田间病叶水浴法提取的dna均可特异性扩增产生梯形条带，但田间病叶水浴法提取的dna的lamp产物呈绿色且和健康叶片产物的颜色差别不大，无法通过颜色变化判断。因此，如果采取水浴法提取田间疑似病叶dna进行lamp检测，必须经2.0%琼脂糖凝胶电泳验证产物是否有典型的梯形条带产生。76.、lamp田间检测时病斑数量的优化在上述试验结果的基础上，再次进行了牡丹黄斑病斑数量的优化。即用水浴法分别提取1、10、20、30、40和50个病斑的dna进行lamp检测，同时取牡丹黄斑病菌基因组dna和ddh2o为对照。结果如图12所示：病斑数从30至50个时，反应液颜色逐渐变为天蓝色，但仍受到病斑中色素的干扰，电泳图从30至50个均有典型的梯形条带产生。病斑数40个时，天蓝色较为明显，且受色素的干扰较小。因此采用水浴法从牡丹黄斑病病斑中提取dna时，病斑数不宜过多，以40个为宜。77.以上图10~图12，其实是一脉相承的。图10，说明可以简单的从病菌菌落中提取dna，而不需要像ctab法那样操作繁琐；图11，说明简易法提dna，对牡丹叶片也是适用的，但叶片病斑数量会有影响。图12，对病斑数量进行了优化，最终确定了40个病斑合适。78.、lamp在牡丹园及牡丹基地的应用分别在洛阳市国家牡丹园、河南科技大学牡丹园、洛阳市国际牡丹园以及洛阳市中国国花园采集疑似牡丹黄斑病病叶，并进行了lamp检测。79.洛阳市国家牡丹园的结果如图13所示：田间病斑dna的5份lamp产物中有4份表现为阳性，反应液颜色为天蓝色，但仍受到病斑中色素的干扰，电泳图中有典型的梯形条带产生。80.河南科技大学牡丹园的结果如图14所示：田间病斑dna的5份lamp产物均表现为阳性，反应液颜色为天蓝色，但仍受到病斑中色素的干扰，电泳图中均为典型的梯形条带。81.洛阳市国际牡丹园的结果如图15所示：田间病斑dna的5份lamp产物均表现为阳性，反应液颜色为天蓝色，但仍受到病斑中色素的干扰，电泳图中均为典型的梯形条带。82.洛阳市中国国花园的结果如图16所示：田间病斑dna的5份lamp产物中有4份表现为阳性，反应液颜色为天蓝色，但仍受到病斑中色素的干扰，电泳图中有典型的梯形条带产生。83.综上可知，该lamp体系检测牡丹黄斑病菌的实用性很强。84.本发明的技术路线图如图17所示。85.现有诊断方法和lamp检测技术的对比，如下表2所示。86.表2现有诊断方法与lamp检测方法的比较。87.本发明是lamp检测技术在牡丹黄斑病菌检测中的首次研究，可为牡丹黄斑病的快速诊断与早期监测提供重要依据。88.1、本发明建立的简便快速检测斑点叶点霉的方法。89.首先以牡丹黄斑病菌its序列的特异性片段为靶标，设计了3套lamp引物，然后从中筛选出最佳的特异性lamp引物，之后优化并建立lamp反应体系，进行lamp的特异性和敏感性检测。结果表明：本研究设计的3套lamp引物均可特异性检测牡丹黄斑病菌；反应体系中各试剂的最佳终浓度如下：bst 3.0 dna polymerase 0.32 u/μl、10×thermopol buffer 2.5 μl、dntp 1.0mmol/l、mg2+6 mmol/l、f3和b3各0.2 μmol/l、fip和bip各1.6 μmmol/l、hnb 0.15 mmol/l、甜菜碱 1 mol/l、模板dna 1 μl、加ddh2o补至25 μl；特异性检测只有牡丹黄斑病菌的产物呈阳性；其灵敏度检测是普通pcr的100倍；65 ℃水浴加热提取病菌dna的简化方法可用于lamp检测，电泳显示典型的梯形条带。90.2、牡丹黄斑病早期诊断上的应用。91.本发明摸索了从发病组织中提取病菌dna的简化操作方法，最后对该技术在田间早期诊断应用的效果以及实用性进行了评估。对田间疑似病叶简化法提取的dna进行lamp检测，结果均呈阳性。但采取水浴加热法提取病斑中的dna，很难克服病斑中色素的干扰，当病斑数过多时，不能仅通过颜色反应来判断是否产生了阳性扩增，还需进一步通过2.0%琼脂糖凝胶电泳来验证。采用水浴法从牡丹黄斑病病斑中提取dna时，病斑数不宜过多，以40个为宜。该lamp体系的实用性很高，在本发明研究的4个牡丹园中仅个别表现为阴性。92.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。