北京师范大学曹玮教授Chem.Sci:基于合成褐黑素的研究阐明天然褐黑素大分子的电子、分子及超分子结构

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近日，北京师范大学曹玮教授与美国西北大学Nathan Gianneschi教授合作研究了褐黑素的人工合成、结构及其性质。首先，通过氧化聚合的方法得到合成褐黑素，多种表征均表明该合成产物具有与天然褐黑素相似的结构。其次，通过研究合成褐黑素的结构与性质，提出了阳离子-π相互作用是合成褐黑素的重要驱动力，该发现加深了对于天然褐黑素这种重要生物色素的认识。

黑色素是一种广泛存在于自然界中大分子生物色素，在着色、伪装、热调节、光保护和辐射防护等领域均具有多种重要功能。人类的表皮色素沉着通常被认为与真黑素和褐黑素有关。目前，真黑素相关的结构和性质已经得到了较为充分的研究，其表亲褐黑素尽管在红头发和白皙的皮肤中普遍存在，但相关研究却要少得多。通常认为褐黑素具有光毒性，然而从进化的角度来看，它在一定程度上对生物体起到了某些有益的作用。事实上，一些研究表明褐黑素可以提供比真黑素更好的电离辐射防护；褐黑素还和帕金森病(PD)有关。然而关于褐黑素的结构与功能的相关研究长期以来并不清晰，甚至相互矛盾，这使得我们很难具备完整的认识和理解。原因可能是由于褐黑素的结构比常见的真黑素更为复杂，并且自然界中没有纯净的褐黑素存在。因此，为了更好地了解褐黑素的功能，对其结构进行准确的表征是必不可少的。

1.褐黑素的化学合成

文章首先讨论了人工褐黑素的合成方法。根据先前的工作，作者通过对方法1)和方法2)两种合成方法所得的产物进行了 13C ssNMR波谱分析，发现其在芳香区的峰与预计的结构差异较大，因此认为这两种方法合成的产物与天然褐黑素有较大差异。在这种情况下，作者使用5-半胱氨酸基-多巴(5-CD)进行酶促氧化聚合，得到产物与天然褐黑素具有较高的相似性。

图1 使用不同方法化学合成褐黑素。(A)(方法1) KMnO4用于氧化pH=7的水中半胱氨酸和L-DOPA的溶液相混合物; (方法2)在酪氨酸酶存在下，使用氧气氧化磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的半胱氨酸和L-DOPA; (方法3)以5-半胱氨酸基-多巴(5-CD)为起始原料，经辣根过氧化物酶(HRP)和H2O2进行化学酶氧化。(B)三种方法合成的褐黑素样品的CP-MAS 13C ssNMR波谱。

该聚合反应最初呈浅黄色，在加入H 2O 2与HRP后呈现出亮黄色。在24小时内溶液颜色逐渐由黄色变为橙色、红色，最终变为深红棕色。该现象与传统的基于聚多巴胺(PDA)以及聚左旋多巴合成真黑素的途径不同，此二者在较短时间内溶液颜色就会从黄色变为棕色最终变为黑色溶液。在合成过程中通过紫外可见光谱进行监测，随着反应的进行其共轭结构逐渐延伸并且形成了更多的聚合物。通过扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)可以看出反应产生了不规则的胶体。聚合物的傅里叶变换红外光谱(FTIR)也显示出了宽的吸收带，与其单体有较大的差异。通过与先前所描述的褐黑素的 13C ssNMR结果进行比较，此种方法合成的褐黑素具有类似天然褐黑素的苯并噻嗪结构。

图2 以5-半胱氨酸-多巴(5-CD)为起始原料化学合成褐黑素。(A)反应各个阶段的颜色变化。(B)反应体系在500nm处的吸光度变化。(C)合成褐黑素的代表性SEM图像。(D)傅里叶变换红外光谱和(E)5-CD单体和褐黑素的13C ssNMR波谱。

2.合成褐黑素与不同来源的天然褐黑素的比较

为了更好地将合成褐黑素与天然褐黑素进行对比，通过生物酶提纯法从罗德岛公鸡羽毛以及两位捐献者的红发中对褐黑素进行了提取，相对于化学提取，该方法能够更好地保护天然褐黑素的结构。将经过处理的天然褐黑素样品进行包括SEM，DLS，ssNMR在内的多种表征，得到了与先前报道一致的结果。

图3 从鸟类羽毛中提取的天然褐黑素和两个人的红色毛发。(A)-(C)分别从公鸡羽毛，人类红色毛发I和人类红色毛发II中提取的天然褐黑素样品的光学图像和SEM图像。(D)–(F)相应天然褐黑素的 DLS 图。插图是褐黑素分散体的光学图像。

与合成褐黑素一样，对天然提取样品进行固态核磁共振(ssNMR)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、紫外可见光谱(UV-Vis)的测试。ssNMR的结果表明从合成褐黑素在芳香区与鸟类羽毛中提取的褐黑素相似。同时FTIR与UV-Vis的图像也可佐证合成褐黑素具有与天然提取物具有类似的结构。

图4 合成褐黑素与天然褐黑素的比较。本实验使用了四个样品：合成5-CD褐黑素，从公鸡羽毛中提取的褐黑素和两位捐献者的红色毛发。(A) CP-MAS 13C ssNMR合成和天然褐黑素的13C ssNMR波谱叠加。插图是放大的芳香区域。(B)傅里叶变换红外光谱和(C)合成和天然褐黑素的紫外可见吸收光谱。

3.合成褐黑素与PDA真黑素的表面性质及颜色比较

基于聚多巴胺型真黑素的表面化学引起了研究者的广泛兴趣，作者研究了合成褐黑素与PDA相比的表面性质。通过将载玻片浸没在聚合反应溶液中来制备褐黑素薄膜，并通过类似的方法制得PDA薄膜，根据接触角实验可以直观地看出合成褐黑素具有更好的亲水性。同时，合成褐黑素对于其他基材也都有很好的附着效果。

图5 合成褐黑素与PDA模拟真黑素的表面性质和颜色比较。(A)褐黑素薄膜，(B)PDA薄膜和(C)空白玻璃的静态水接触角图像。通过SEM对(D)褐黑素薄膜，(E)PDA薄膜和(F)空白玻璃进行表面形貌分析。(G)光学照片显示了平面基材(包括玻璃、聚苯乙烯和金基板)上褐黑素涂层前后的颜色变化。(H)用合成真黑素和褐黑素涂覆前后的3D打印物体。(I)合成真黑素和褐黑素分散体在浓度为1 g/L时的颜色。

4.电子结构的对比

电子顺磁共振波谱(EPR)的结果揭示了褐黑素中存在稳定的自由基物种。合成褐黑素各向异性氮超细分裂的结果，与从公鸡羽毛中提取的天然褐黑素相似，说明了其与天然褐黑素具有相似的化学结构。为了更好地了解褐黑素和真黑素之间的差异，测量了其连续波EPR功率饱和曲线和瞬态EPR波谱，并且结果表明以5-CD为单体的合成褐黑素与天然褐黑素行为相似，与基于PDA的真黑素不同。

图6 合成褐黑素与PDA模拟真黑素和天然褐黑素的顺磁性比较。(A)衰减功率为30 dB 时的 EPR 频谱。(B)三个样本的功率饱和曲线。(C)三个样本的纵向弛豫时间T1和拟合图。空心点是脉冲EPR实验值，实线是拟合曲线。(D)自旋浓度汇总表，P1/2和T1弛豫时间。

5.通过受控分解阐明阳离子-π相互作用

在自然界中，阳离子-π相互作用与许多主要的生物分子的识别和功能有关，如乙酰胆碱。同时在生物大分子中阳离子-π对蛋白质的稳定性也做出了显著的能量贡献。而黑色素作为一种生物大分子，阳离子-π相互作用也可能对其有结构有重要意义。与研究较多的PDA相比，褐黑素缺乏完善的模型体系来研究其超分子相互作用，故作者选择合成褐黑素薄膜作为模型来研究其超分子相互作用。

如果阳离子-π相互作用是褐黑素超分子形成的主要驱动力，那么铵离子的去质子化将会导致褐黑素薄膜的解离。基于此作者开展了相关实验证实了阳离子-π相互作用的消失将会使得褐黑素薄膜解离，该结果与预测的结论相符。对于褐黑素超分子结构的研究可以更好地帮助开发新的人工褐黑素合成路径，同时对于阐明褐黑素的特性以及生物功能也有重要的推进作用。

图7 合成褐黑素中的阳离子π相互作用。(A)阳离子π相互作用和碱触发的褐黑素膜分解的示意图说明。(B)光学图像显示了原始褐黑素薄膜的颜色变化，以及分别用pH=10溶液，NaCl(0.5M)和KCl(0.5 M)溶液处理后的薄膜。(C)每个褐黑素薄膜样品的紫外可见光谱。(D)400 nm处的吸光度比较和统计测试。误差条表示单个实验中>4 次测量的标准偏差。NS 表示无统计学差异 P>0.1， ***：P /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端