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图一：IL-1 beta靶点蛋白结构。图片来源：SWISS-MODEL。IL-1 beta靶点介绍蛋白功能蛋白表达蛋白定位异构体 & 翻译后修饰WB实验贴士注意事项阳性对照阴性对照结果示例关键控制点参考文献IL-1 beta靶点介绍蛋白功能 IL-1 beta是由许多不同类型的免疫和非免疫细胞，在迅速响应炎症信号后产生和释放的。 大多数IL-1家族成员的生物发生与其他细胞因子的不同之处在于，大多数白介素IL-1是以非生物活性的酶原形式产生，然后经蛋白水解的成活性形式。髓系细胞中IL-1 beta(和IL-18)的N端加工是由炎症小体的效应成分caspases完成。 IL1 beta的产生分两步进行，每一步都受到不同刺激的调控。首先，炎症信号，如LPS，刺激pro-IL1 beta的合成，并促进其在细胞质储存积累。然后炎症小体组装需要额外的信号，导致CASP1激活，pro-IL1beta加工，并最终以活性细胞因子形式分泌。 IL-1 beta通过与TNF和IL6协同诱导VEGF的产生，在血管生成中发挥作用。 蛋白表达IL-1 beta在活化的单核细胞/巨噬细胞中表达(蛋白水平)。 IL-1 beta被LPS刺激表达。在巨噬细胞中的转录和翻译，IL-1beta可被结核分枝杆菌和多种不同结核分枝杆菌组分刺激，其中EsxA是实验过最有效的激活子(在蛋白质水平)。在胰岛组织中，高糖治疗增加IL-1 beta的释放。在胰岛和巨噬细胞中，endocannabinoid anandamide/AEA也增加IL-1 beta的释放。 蛋白定位细胞质，溶酶体，外泌体，分泌。 前体在细胞质定位，响应炎性小体激活信号后，如NLRP3炎性小体的ATP或NLRC4炎性小体的细菌鞭毛蛋白，被切割并分泌。 图二：IL-1 beta靶点ICC实验结果图，Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]产品(ab254360)。绿色：IL-1 beta，红色：alpha Tubulin，蓝色：DAPI。异构体 & 翻译后修饰人（P01584）：30.7 kDa（预测） 小鼠（P10749）：30.9 kDa（预测） 大鼠（Q63264）：30.6 kDa（预测） IL-1 beta前体的激活涉及CASP1催化的蛋白水解。加工和分泌是暂时相关的。 回到顶部WB实验贴士 注意事项为了提高样本中IL-1 beta的含量，对于免疫细胞，推荐使用TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)/PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate) 进行预处理（图三），它们是一类常用的佛波酯，能结合并激活蛋白激酶 C，实现细胞内信号传递，并使多种不同免疫细胞产生细胞因子。 IL-1 beta不是组成型表达的，IL-1 beta无论是前体还是成熟体，可能都需要刺激才能检测到（图四、五 ）。产品说明书或者文献提供的诱导条件仅供参考。若需检测不同样本中IL-1 beta，请先进行诱导试剂浓度和诱导时长的摸索优化，获得最适诱导条件的情况下再进行正式检测。此外，刺激的强度和类型影响IL-1 beta的剪切和分泌，并且不同的产品其要求的刺激强度也可能不同。建议参考具体产品说明书。另外可以选择多个产品一起验证诱导条件，或者用同一通路靶点比如TNF alpha一起检测，确保诱导条件是合适的。 IL-1 beta是分泌型蛋白，建议使用抑制分泌试剂（例如Brefeldin A）处理细胞（图三、五），抑制IL-1 beta分泌到细胞外。 为了保持实验的成功性和可重复性，请注意待检测细胞培养密度的一致性。以THP-1来源的巨噬细胞为例，由于群体感应的影响，偏低或过高的细胞密度都会影响包括IL-1 beta在内的细胞因子分泌。 IL-1 beta的前体pro-IL-1 beta在31 kDa左右，刺激后约266个氨基酸的pro-IL-1 beta前体被切割成约153个氨基酸的IL-1 beta成熟形式的。 IL-1 beta在不同组织细胞中的表达不同，有些样本可能会出现弱表达或无表达的情况。请选择合适的实验样本，推荐使用阳性对照，以确认实验体系没有问题。 IL-1 beta 在种属间的同源性不是很高，例如人源IL-1 beta与小鼠来源IL-1 beta有67%同源性，与大鼠来源IL-1 beta有66%同源性，因此在选择产品时，建议优先选择免疫原与待测样品同源的产品。 阳性对照人： TPA预处理，然后LPS和BFA处理的THP-1全细胞裂解液；U-87MG全细胞裂解液 小鼠：LPS和BFA处理的RAW 264.7全细胞裂解液 阴性对照(无表达或弱表达)人：未处理的THP-1全细胞裂解液 小鼠：未处理的RAW 264.7全细胞裂解液 结果示例图三：WB- Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]（ab254360） 泳道1：20 µg未处理的RAW 264.7全细胞裂解液泳道2：100 ng/ml LPS处理7小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理的RAW 264.7全细胞裂解液 泳道3：未处理的THP-1全细胞裂解液 泳道4：80 nM TPA过夜处理，然后100 ng/ml LPS处理6小时，并在最后3小时加入Brefeldin A处理的THP-1全细胞裂解液 一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR23851-127]一抗，浓度1/1000稀释。 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/50000稀释。 曝光时间：3min预测条带大小：31 kDa 检测条带大小： 17.5, 28, 31kDa 注意：IL-1 beta的表达需要LPS诱导。31 kDa条带是前体形式的IL-1 beta，28 kDa条带和17.5 kDa条带是蛋白水解的IL-1 beta。表达模式、分子量与文献描述一致（PMID: 8446594, 19559631）。 图四：WB-Anti-IL-1 beta antibody [EPR21086]（ab216995） 泳道1：20 µg未处理的THP-1全细胞裂解液泳道2：20 µg 100 ng/ml LPS处理3小时的THP-1全细胞裂解液 一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR21086]一抗，浓度1/1000稀释。二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/100000稀释。 曝光时间：3min预测条带大小：31 kDa 图五：WB- Anti-IL-1 beta antibody [EPR16805-15]（ab234437） 泳道1：10 µg未处理的RAW 264.7全细胞裂解液 泳道2：10 µg 100 ng/ml LPS处理6小时，然后在最后3小时加入300 ng/ml Brefeldin A处理的RAW 264.7全细胞裂解液 一抗：使用Anti-IL-1 beta antibody [EPR16805-15]一抗，浓度1/1000稀释 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051)二抗，浓度1/100000稀释。 预测条带大小：31 kDa 检测条带大小：17, 28, 31 kDa 关键控制点在实验中除了需要注意常规问题外，还要特别关注以下关键控制点： 样本制备 添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。 整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。 建议使用阳性和阴性对照。 电泳 至少上样20μg总蛋白进行电泳。 对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量 |
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