麻醉药物异丙酚调节Src表达从而促进肺部肿瘤转移

循环肿瘤细胞(CTCs)的产生是肿瘤转移的关键步骤，通常发生在全麻下的手术肿瘤切除过程中。异丙酚是常用的麻醉药物，但其对CTCs和肿瘤转移的作用仍不清楚。2021年9月，Zhongcong Xie等人在《Advanced science》杂志上发表了一篇题为《Anesthetic Propofol Promotes Tumor Metastasis in Lungs via GABAAR-Dependent TRIM21 Modulation of Src Expression》的文章，采用体外肿瘤细胞-血管内皮细胞粘附实验、免疫荧光等方法评估异丙酚对肿瘤细胞黏附和延伸的影响。现介绍如下：     

背景   

据报道，麻醉和手术等围手术期因素与肿瘤患者的预后不良有关，包括死亡率和复发率增加。与区域麻醉相比，全身麻醉与更高的肿瘤复发率和死亡率有关，但存在相互矛盾的报道。最近的一项研究评估了196303例消化系统肿瘤患者，并没有发现接受不同麻醉药物的患者在肿瘤转移或复发方面存在差异。   特别是常用的麻醉药异丙酚对肿瘤预后的影响还存在争议。在某些情况下，与其他麻醉药(包括七氟醚)相比，异丙酚可能改善肿瘤预后。另一方面，异丙酚麻醉下接受乳腺癌手术切除的患者循环肿瘤细胞(CTCs)的生成计数与七氟醚麻醉相比无显著差异。在手术切除肿瘤期间发生的CTCs，是肿瘤转移和复发的关键。此外，尽管一些细胞培养研究报告异丙酚可以调节肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，但这些体外研究使用异丙酚时间更长(如24-72小时)或多次给药。因此，建立更多与临床相关的模型来确定异丙酚对CTCs和肿瘤转移的影响是非常重要的。   

最近，Li等人系统比较了麻醉药对肿瘤转移的作用差异，报道吸入麻醉药七氟醚通过改变肺内肿瘤微环境，使乳腺癌手术切除小鼠的肺转移率明显高于异丙酚。 然而，该研究并没有证明麻醉药本身(相对于非麻醉条件)是否能促进或抑制肿瘤进展。因此，与低剂量异丙酚或非麻醉条件相比，标准剂量异丙酚是否能促进肿瘤转移尚不清楚。   

为了评估这一点，作者采用了一种常用于研究肿瘤转移的实验转移小鼠模型，而不是自发转移模型，以确定与低剂量异丙酚或非麻醉条件相比，标准剂量异丙酚对肿瘤转移的影响。这是因为虽然自发转移模型在体内肿瘤研究中很有价值，但在自发转移模型中，不可能使用低剂量异丙酚或非麻醉条件下进行肿瘤切除。   

作者将肿瘤细胞和低剂量或标准剂量的异丙酚依次通过尾静脉注射到裸鼠体内，以从概念上模拟异丙酚与CTCs混合的条件。作者还通过裸鼠尾静脉注射异丙酚或载体处理的肿瘤细胞，以进一步确定异丙酚和非麻醉条件对肿瘤转移的影响。这两种方法在概念上可以代表标准剂量异丙酚全身麻醉与区域麻醉联合或不联合低剂量异丙酚镇静的临床情况。   手术切除肿瘤可在血液中产生CTCs。肿瘤转移始于癌细胞从其原发部位的局部迁移和侵入血液(内渗)，随后CTCs粘附到血管内皮细胞(VECs);最后，CTCs离开血流(外渗)。在外渗过程中，CTCs粘附在VECs上，并且这些具有膜突起的肿瘤细胞的延伸使细胞更容易粘附并进一步穿透VECs，离开血管，浸润并定植于不同的器官。因此，CTCs黏附和延伸到VECs是肿瘤转移过程中的关键步骤。在本研究中，作者特别关注异丙酚对外渗(如黏附和延伸)的影响，而不是对内渗(如迁移和侵袭)的影响。   异丙酚是一种A型γ-氨基丁酸受体(GABAAR)激动剂。GABAARs存在于外周组织中，并促进某些肿瘤细胞的迁移和侵袭。 因此，作者试图确定异丙酚是否可以通过增强裸鼠体内肿瘤细胞的黏附和延伸来促进肿瘤转移，并通过对GABAAR的作用在体外促进肿瘤转移。   

其他因素是肿瘤转移的重要调节因素。Src是一种非受体细胞质激酶，介导局灶性粘连的形成和肌动蛋白丝的排列以实现细胞延伸，从而调节肿瘤细胞转移。Src表达的上调对Src激活至关重要，它可以在许多肿瘤中检测到，包括结肠、肺、乳腺和子宫内膜肿瘤。Src可以调节肿瘤细胞的迁移和侵袭。Src的激活促进乳腺肿瘤细胞外渗到脑实质中。抑制Src活性可有效降低结直肠癌细胞系SW620和HT29对成纤维细胞的粘附。值得注意的是，PP2是Src激活的特异性抑制剂，可以减少肿瘤转移。此外，Src可以通过泛素化快速代谢。因此，作者评估了异丙酚是否可以作用于GABAAR，通过影响Src泛素化来调节Src表达，从而影响肿瘤转移。   此外，三方基序(TRIM)蛋白家族成员有助于肿瘤细胞转移。TRIM21通过Snail和IκB激酶β的泛素化和降解来抑制肿瘤转移的进展。 

此外，TRIM21可以调节单核细胞对内皮细胞的粘附。TRIM21还与细胞骨架蛋白相互作用。TRIM21与F-肌动蛋白共定位，可抑制TRIM21功能。因此，TRIM21可能调节异丙酚对肿瘤转移、肿瘤细胞与内皮细胞之间的粘附以及细胞骨架蛋白(如F-肌动蛋白)的作用。然而，异丙酚是否可以作用于GABAAR以调节TRIM21表达，导致Src表达的变化以及因此而改变黏附和延伸，仍然未知。   因此，本研究的目的是探讨异丙酚对肿瘤细胞转移的影响以及这些影响的潜在机制。作者假设，与低剂量异丙酚或非麻醉条件相比，标准剂量异丙酚通过GABAAR-TRIM21-Src机制促进肿瘤转移。结果发现异丙酚活化GABAAR降低TRIM21的表达，增加Src的表达，增强肿瘤细胞黏附和延伸，从而促进小鼠肺内肿瘤转移。   

结果   

异丙酚促进GABAAR介导的肿瘤细胞转移   

通过尾静脉向裸鼠体内依次注射HCT116细胞和低剂量或标准剂量的异丙酚(图1a)。注射后4周小鼠肺部的离体生物发光成像显示，与低剂量的异丙酚(20mg/kg）相比，标准剂量异丙酚(240mg/kg/h，超过1h)治疗导致肿瘤转移显著增加,以光子强度(7.59±0.43 vs 9.14±1.11,P=0.019,)(图1b,c)和结节数(16.55±15.49 vs 39.6±18.57,P=0.031,)(图1d,e)表示，提示异丙酚在体内可促进肿瘤细胞肺转移。   接下来，作者比较了异丙酚麻醉和非麻醉条件对肿瘤转移的影响，方法是通过尾静脉将异丙酚处理的与载体（DMSO）处理的HCT116细胞注射到裸鼠体内(图1f)。结果发现注射后4周，与DMSO处理的肿瘤细胞相比，异丙酚处理的肿瘤细胞增加了光子强度(7.31±0.47 vs 7.98±0.16,P=0.019)(图1g,h)和结节数(15.44±7.21 vs 42.33±14.62,P=0.001,)(图1i,j)。这些数据进一步表明，异丙酚可能促进小鼠肿瘤向肺转移。   在体外，与对照组相比，异丙酚治疗导致更多的HCT116细胞粘附在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的单层上(图1k,l)。异丙酚还诱导了更大的细胞膜突起延伸，具有更明显的F-肌动蛋白结构(图1m)。通过局灶性黏附蛋白Talin和Vinculin的免疫荧光染色检测到异丙酚增加了局灶性黏附位点(图1n)，进一步证明异丙酚增加了HCT116细胞的粘附。异丙酚还能增强其他肿瘤细胞系的黏附和延伸，包括小鼠结直肠肿瘤细胞系CT26、乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231、人非小细胞肺癌细胞系A549和子宫内膜癌细胞系Ishikawa。   异丙酚是一种GABAAR受体激动剂。作者发现了GABAAR拮抗剂bicuculine诱导HCT116细胞膜电位去极化，表明细胞具有功能性GABAAR。此外，与异丙酚一样，在裸鼠中与对照HCT116细胞相比，GABAAR激动剂muscimol处理的HCT116细胞也增加了肿瘤的肺转移(图1o-r)。体外研究也表明，与对照条件相比，muscimol增强了HCT116细胞(图1s-v)以及其他肿瘤细胞系如CT26、MDA-MB-231、A549、Ishikawa的黏附和延伸。   用GABAAR拮抗剂bicuculine或苯二氮卓类拮抗剂氟马西尼在体外治疗HCT116细胞降低了细胞黏附，苯二氮卓类激动剂地西泮增加了细胞黏附和延伸。作者进一步证实GABAAR拮抗剂bicuculine减弱了异丙酚诱导的HCT116细胞粘附和延伸的增强。此外，GABAAR亚基β3和δ的敲除(KO)降低了HCT116的一般粘附和延伸能力，并特异性的减弱了异丙酚促进的HCT116的粘附和延伸。然而，NMDA受体拮抗剂MK-801和乙酰胆碱受体拮抗剂苯乙铵不能调节HCT116细胞的粘附。这些数据表明，异丙酚通过增强肿瘤细胞的黏附和延伸来促进肿瘤细胞的转移，特别是通过作用于GABAAR。  

图1 异丙酚和GABAAR激动剂muscimol通过增强肿瘤细胞黏附和延伸促进小鼠肺内肿瘤转移

异丙酚通过调节GABAAR依赖的Src泛素化来增强细胞粘附和延伸

异丙酚(图2a)和muscimol(图2b)处理上调了HCT116细胞中Src和磷酸化Src(p-Src)的表达量，而bicuculine处理(图2c)下调了Src和p-Src的表达。然而muscimol和bicuculine均未显著改变Src mRNA的表达(图2d)。此外，bicuculine(图2e)促进了Src的泛素化，而异丙酚(图2f)和muscimol抑制了Src的泛素化。GABAAR亚基β3和δ的敲除降低了Src蛋白水平，并阻断了异丙酚上调Src和p-Src表达的功能。此外，在环己酰亚胺(CHX)追踪实验中，即使在异丙酚处理后12小时，muscimol或异丙酚处理Src蛋白的实验半衰期也显著延长(在本研究中估计为4-8小时)。用泛素活化酶(E1)抑制剂PYR-41处理HCT116细胞，上调Src和p-Src表达，并促进细胞粘附和延伸。同样，Src过表达促进了HCT116细胞的粘附和延伸(图2g)。用Src抑制剂PP2 (10×10−6 m)处理HCT116细胞降低了Src和p-Src的表达，减少了细胞粘附和延伸。同样，PP2降低了人结直肠癌细胞(HT29)和小鼠结直肠癌细胞(CT26)对HUVECs的粘附。在机制上，PP2减弱了PYR-41诱导的Src和p-Src上调以及PYR-41诱导的HCT116细胞黏附和延伸的增强。局灶性黏附激酶(FAK)在肿瘤细胞中与Src形成复合物，以调节生长和转移。然而，异丙酚对FAK的磷酸化没有显著的调节作用。这些数据表明，FAK可能不会促成异丙酚促进的肿瘤转移。   

此外，Src的过表达恢复了bicuculine诱导的Src和p-Src的减少(图2h)，并减弱了bicuculine诱导的HCT116细胞粘附和延伸的抑制(图2i-m)。此外，PP2减弱了异丙酚诱导的HCT116细胞 (图2n,o)以及其他细胞（包括HT-29和CT26细胞）粘附和延伸的增强。Src的RNAi敲除(图2p)抑制了HCT116细胞的粘附能力，并阻断了异丙酚促进的粘附和延伸(图2q,r)。这些数据表明，异丙酚通过作用于GABAAR来抑制Src的泛素化，导致Src的积累，从而促进肿瘤细胞的黏附和延伸。       

图2 异丙酚通过GABAAR依赖的Src表达增强HCT116细胞的粘附和延伸

GABAAR通过TRIM21上调Src   

异丙酚(图3a)和muscimol(图3b)处理HCT116细胞减少了TRIM21蛋白的数量。但异丙酚不调节TRIM21的转录(图3c)。Bicuculine上调TRIM21的表达(图3d)。TRIM21过表达下调了Src(图3e)，但没有显著改变Src mRNA的表达(图3f)。TRIM21过表达也促进了Src的泛素化。最后，共免疫沉淀(Co-IP)试验并未显示E3连接酶TRIM21与Src之间存在直接相互作用。相反，HCT116细胞中TRIM21的RNAi敲除上调Src和p-Src的表达，促进细胞粘附和延伸。重要的是，TRIM21过表达减弱了HCT116细胞的黏附和延伸，通过Src的过表达恢复了这种黏附和延伸(图3g-k)。   TRIM21过表达也减弱了异丙酚诱导的Src上调和HCT116细胞在HUVECs上的粘附(图3l,m)。TRIM21过表达减弱了muscimol诱导的HCT116细胞黏附和延伸的增强(图3n-q)。这些数据表明，GABAAR激活通过减少TRIM21来增加Src，导致HCT116细胞黏附和延伸增强。

图3 TRIM21调节Src蛋白水平以介导GABAAR信号传导

抑制Src可减弱异丙酚或muscimol促进的肺部肿瘤转移   

最后，作者采用了药理学而非遗传学方法来确定抑制Src对异丙酚作用的临床相关性更强的影响。离体生物发光测定表明，用Src抑制剂PP2治疗显著减弱了异丙酚诱导的小鼠肺肿瘤结节数量的增加(图4a,b)。组织学分析进一步证实，PP2显著减弱异丙酚促进的HCT116细胞在小鼠肺部的转移(图4c,d)。离体生物发光和组织学分析还证实，PP2显著减弱muscimol促进的小鼠HCT116细胞的转移(图4e-h)。提示PP2可抑制异丙酚对小鼠肺部肿瘤细胞转移的影响。  

图4 Src的抑制减弱了异丙酚或GABAAR激动剂促进的小鼠肺部肿瘤转移

总的来说，这些结果提示了异丙酚激活GABAAR的潜在途径，其引起TRIM21的下调和随后的Src上调，导致肿瘤细胞和VECs的黏附和延伸增强，可能促进肿瘤转移(图5)。

图5 假设的异丙酚促进肿瘤转移的途径

讨论   

这项概念验证研究的数据表明，与低剂量异丙酚或非麻醉条件相比，静脉内给予标准剂量异丙酚与裸鼠肺部更高的肿瘤转移率有关。在机制上，异丙酚通过作用于GABAAR，增强了肿瘤细胞对VECs的粘附和延伸，这是肿瘤转移的关键步骤。GABAAR的活化降低胞质泛素连接酶TRIM21的表达，导致Src的表达增加，Src是一种与VECs细胞粘附相关的蛋白。   

作者发现在裸鼠中，与低剂量相比，标准剂量异丙酚治疗促进了肿瘤向肺部转移。通过尾静脉注射不同剂量的异丙酚来比较低剂量和标准剂量异丙酚对肿瘤转移的影响。然而,此设置不允许作者确定异丙酚麻醉与非麻醉条件的影响,因为不能在没有全身麻醉的情况下，通过尾静脉持续泵注（＞1h）相同体积(600µL)的脂肪乳剂。将不含脂肪乳剂的HCT116细胞注射到小鼠体内会引起混杂性影响，因为没有给小鼠体内注射异丙酚载体。因此，作者在实验中采用低剂量异丙酚作为对照条件，这也代表了采用标准剂量异丙酚用于全麻或低剂量异丙酚用于区域麻醉期间镇静的患者的临床情况。   

为比较异丙酚麻醉与非麻醉状态对肿瘤转移的影响，作者建立另一系统，将异丙酚溶于DMSO和DMSO(载体)单独预处理肿瘤细胞3h，随后将这些预处理后的肿瘤细胞经尾静脉注入小鼠体内。结果发现，与载体处理的肿瘤细胞相比，异丙酚处理的肿瘤细胞也导致裸鼠肺部发生更大的转移。这些结果进一步提示，与非麻醉状态相比，异丙酚会促进小鼠肿瘤转移。   机制上，异丙酚通过作用于GABAAR增强肿瘤细胞对VECs的粘附和延伸，是肿瘤转移的关键步骤. GABAAR的活化降低胞质泛素连接酶TRIM21的表达，增加与VECs细胞粘附相关的蛋白Src的表达。   

鉴于本研究的目的是确定标准剂量异丙酚对肿瘤转移的影响（与低剂量异丙酚或非麻醉状态相比），实验转移模型是最合适的选择。虽然自发转移模型对体内研究有价值，但在这类小鼠模型中，不可能在低剂量异丙酚或非麻醉条件下进行肿瘤切除。实验转移小鼠模型通过尾静脉注射肿瘤细胞和异丙酚来规避这一限制。   异丙酚是手术患者常用的麻醉药，手术切除肿瘤可能与CTCs的生成有关，是肿瘤转移的关键步骤。然而，以往的研究多集于评估异丙酚对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，而对CTCs黏附的影响没有研究。在本研究中，通过在小鼠尾静脉注射异丙酚前立即注射肿瘤细胞，将肿瘤细胞与异丙酚混合在小鼠血液中，来特异性评估异丙酚对CTCs的影响。作者还将肿瘤细胞与异丙酚混合于细胞培养液中，经尾静脉注射异丙酚处理的细胞给小鼠。   最近的一项研究表明，在同基因小鼠4T1和人MDA-MB-231乳腺癌移植模型中，异丙酚比七氟醚能减少肺转移，显示了不同麻醉药对肿瘤转移的影响。具体来说，七氟醚通过调节炎症细胞因子和激活肺内STAT3通路促进肺转移。然而，该研究并没有比较标准剂量麻醉药(如异丙酚)与低剂量相同麻醉药或非麻醉药(对照条件)对肿瘤转移的影响。此外，该研究还确定了麻醉药对肿瘤微环境的影响是其作用机制，而非肿瘤细胞本身。   

相比之下，本研究通过药理学和基因调控GABAAR和TRIM21的表达，发现异丙酚作用于GABAAR依赖的TRIM21，调节肿瘤细胞Src的表达，导致较非麻醉对照组更多的肺转移。这些发现将促进未来的体内研究方法(例如，利用双光子显微镜观察细胞粘附的急性动态过程)进一步揭示GABAAR，TRIM21和Src在异丙酚对体内肿瘤转移影响中的作用。   另一项研究报告异丙酚(2-10μg/mL，6h)促进口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭; 孟等人也报道异丙酚(2-10µg/mL，1-12 h)可增加人乳腺肿瘤细胞的增殖和迁移;以及Garib等研究表明异丙酚(6µg/mL)能促进乳腺癌细胞的迁移。本研究结果也表明，异丙酚处理的细胞更容易粘附VECs，有更多的局灶性黏附位点，并表现出更大的延展性，促进肿瘤进展。   Src的激活有助于上皮间质转化(EMT)，发生于内渗过程中。Src可磷酸化局灶黏附蛋白进一步调节肿瘤转移。此外，Src还能促进间充质上皮转变(MET)相关的过程。抑制Src活性抑制了肺癌A549细胞的粘附能力，抑制结直肠癌细胞系SW620和HT29与成纤维细胞的粘附。 因此，Src可以调控肿瘤细胞EMT和MET相关过程。作者发现降低Src可以抑制异丙酚促进的肿瘤细胞黏附和延伸。   

有趣的是，在本研究中，Src激酶抑制剂PP2同时降低了Src和p-Src的量。目前尚不清楚这种观察的深层机制。作者推测磷酸化Src的减少会导致Src的降解增加，因为蛋白磷酸化的某些位点会阻碍蛋白降解酶的作用。前期的研究也证明PP2同时降低Src和p-Src蛋白水平。此外，在Co-IP实验中，作者没有证明E3连接酶TRIM21与Src的直接相互作用，表明TRIM21可以间接调控Src的降解。   

肿瘤细胞粘附发生时间很短，提示调控过程要快。泛素化是一种快速调控蛋白表达的过程。与此相适应，作者发现异丙酚或活化的GABAAR通过抑制Src泛素化而增加Src表达，促进肿瘤细胞向VECs粘附和延伸。此外，GABAAR和局灶黏附蛋白共定位证实了紧密空间调控的直接途径。最终Src抑制剂PP2阻断了GABAAR或异丙酚介导的肺转移。这些结果表明异丙酚可能通过GABAAR调节Src表达的变化来增强肿瘤细胞的黏附和延伸。作者还发现TRIM21可被异丙酚和GABAAR激动剂调节。TRIM21调节Src的表达，从而调节肿瘤细胞的黏附和延伸。总之，这些数据提示了一种潜在的异丙酚-GABAAR-TRIM21-Src-肿瘤细胞粘附/延伸机制。今后的研究有必要进一步检验这种级联反应的存在是否对异丙酚促进的肿瘤转移负责。   

另一方面，多项研究表明异丙酚抑制肿瘤细胞进展。Zhang等人报道异丙酚持续暴露(8µg/mL，每周)可抑制原发结直肠癌移植瘤的生长。Wang等人研究表明，异丙酚(1-10µg/mL)处理24-48h可抑制恶性嗜铬细胞瘤细胞的侵袭、迁移和生长。他们还发现异丙酚(35mg/kg)可抑制异种移植模型中恶性嗜铬细胞瘤的生长。造成结果之间差异的原因尚不清楚。

然而，这些研究在以下几个方面与目前的研究不同：

1)没有评估异丙酚对肿瘤转移的影响，仅采用皮下移植瘤模型；2)部分研究采用异丙酚多次给药；3)治疗时间一般较长。   多项研究表明异丙酚可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。然而，这些研究大多是在体外进行长时间的异丙酚治疗，包括24、48和72小时。在本研究中，作者仅用异丙酚处理肿瘤细胞3h，模拟患者一般手术时间，进行体外(肿瘤细胞的黏附和延伸)和体内(肿瘤转移)实验。此外，与注射肿瘤细胞后再注射低剂量丙泊酚相比，注射肿瘤细胞后再注射标准剂量丙泊酚也增加了肿瘤转移。 “

述评

该研究有几个优点。首先，作者建立了一个系统，从概念上模拟异丙酚遇到CTCs的临床情况。第二，利用实验转移模型显示静脉注射异丙酚促进小鼠肿瘤向肺转移。最后，发现了GABAAR-TRIM21-Src-肿瘤细胞黏附/延伸可能是异丙酚促进肿瘤转移的潜在机制。

该研究也存在几个局限性。首先，作者未将GABAAR敲除或TRIM21过表达HCT116细胞注入小鼠体内，进一步确定GABAAR或TRIM21在异丙酚促进体内肿瘤转移中的作用。这是因为即使在异丙酚从血液中清除后，TRIM21过表达或GABAAR敲除本身也可能在调节肿瘤转移方面具有持久的作用，从而产生潜在的混杂影响。然而，体外实验数据证实了GABAAR或TRIM21通过基因改造在异丙酚促进肿瘤细胞与VECs粘附中的作用。未来利用转基因肿瘤细胞和双光子显微镜观察细胞粘附的急性动态过程的研究，将使我们能够进一步确定异丙酚能否通过体内GABAAR、TRIM21和Src的相互作用促进CTCs与VECs的粘附,从而导致血管内皮的渗透启动外渗过程。第二，如另一项研究所示，作者没有比较异丙酚与其他麻醉药对肿瘤转移的影响。 但该研究的目的是说明与低剂量麻醉或非麻醉对照条件相比，标准剂量的麻醉药能促进小鼠肿瘤转移。第三，低剂量异丙酚(20mg/kg)给药1次，而标准剂量异丙酚(240mg/kg)给药1h以上。这是因为小鼠在低剂量异丙酚作用下会四处走动，无法接受1h的异丙酚输注。因此，作者给小鼠单次注射低剂量异丙酚。

总之，该研究表明常用的麻醉药异丙酚能促进小鼠肺部肿瘤转移。机制上，异丙酚可通过GABAAR, TRIM21和Src相互作用增强肿瘤细胞的黏附和延伸，促进肿瘤转移。最后，抑制Src可能减轻异丙酚促进的肿瘤转移。这些发现很可能会在临床前和临床中促进更多关于麻醉和肿瘤转移的研究，最终导致肿瘤手术切除后患者的预后更好。