3分钟，全面了解miRNA功能研究

在之前的文章中，我们给大家介绍了miRNA的序列查找以及定量的检测方案。随着对miRNA研究的深入，研究者们发现miRNA的功能研究通常从两个方向进行：1.通过外源性补充模拟物miRNA Mimics，上调miRNA增强miRNA对靶标基因的调控作用。2.通过抑制剂来降低 miRNA的作用，即miRNA Inhibitors。除此之外，随着对miRNA功能的进一步深入研究，越来越多的研究人员也在通过试用针对miRNA不同潜在靶标位点的靶标封闭剂（miRNA Target Site Blockers）而对miRNA的靶标位点进行分析，从而对其发挥功能的机理获取进一步的了解。 

miRNA Mimics是 针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段，通常是双链，可以上调细胞内相应miRNA的含量。

miRNA Mimics 诱导的基因沉默[1] 

miRNA Inhibitors，是一种经过化学修饰的短单链反义寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotide，ASO），是专门针对特定的miRNA而设计。

调控miRNA的一般策略[2] 

miRNA Target Site Blockers，针对特定miRNA与mRNA 的某些特异性结合位点而设计，可通过占据结合位点来阻断正常miRNA 与靶基因mRNA 的结合， 但不影响 miRNA 与其他不具有该特异性结合位点的靶基因结合。与miRNA Inhibitors相比，miRNA靶标封闭剂可以实现：

在miRNA被抑制后，确定哪一个通路的表型受到影响

在预测的靶标中，哪些miRNA/mRNA的相互作用是最关键的。

根据以上两种miRNA功能研究的思路，QIAGEN基于LNA技术，提供完善的Mimics、Inhibitors及Target Site Blockers。

1.  独特的三链RNA设计，保证miRNA Mimics 高效性和特异性

QIAGEN独特的三链设计，包括一条miRNA链（guide链），序列与miRBase数据库中一致，两条无miRNA活性的passenger链。miRNA链与通过LNA增强修饰的passenger链完全互补并保持双链的稳定性及特异性。其中，只有miRNA链与RISC复合物结合发挥功能，而两条passenger链太短不能作为miRNA发挥作用，从miRNA链上发生移位后被降解。因此，独特的三链设计能够将passenger链的脱靶效应降至最小。 

2. 提供荧光标记和生物素标记的Mimics

众所周知，带有荧光标记的miRNA Mimics可以用于评估转染的效率。然而，在miRNA链的5’或3’端添加荧光标记可能会导致miRNA Mimics的活性消失，相反在passenger链的5’端加入荧光基团是耐受的，所以QIAGEN设计的模拟物保证了Mimics活性的同时，对靶标mRNA没有影响。除此之外，miRCURY LNA miRNA  Mimics还可以实现在miRNA链上直接进行生物素标记，而不影响其发挥作用。

因此，miRCURY LNA miRNA Mimics独特的三链设计和LNA技术的加持保证Mimics的高效性和特异性，多样化的标记修饰方式、规格也让其应用更加灵活。

前面已介绍，miRNA Inhibitors是一种与靶标互补的反义寡核苷酸序列。当转入细胞后，它们将目标miRNA隔离在高度稳定的异源双链核酸结构中，有效地阻止miRNA与靶标基因的结合。miRNA Inhibitors的作用效率取决于其对miRNA靶点的亲和力和形成双链结构的稳定性。miRNA的GC含量差异大（在5-95%之间），这会导致抑制剂的效率会有很大差异，特别是对富含AT的miRNA效率更低。针对这些问题，miRCURY LNA miRNA Inhibitors带来更佳解决方案。

1. 利用LNA的高亲和力，通过改变DNA/LNA中LNA的数量和位置，并确认正确的靶序列，使Tm值在最佳高温度范围内变化。从而确保无论其miRNA靶点的GC含量如何，miRCURY LNA miRNA抑制剂具有相同的高效率。

上图显示，蓝点代表传统的miRNA Inhibitors，红点代表加入LNA的miRCURY LNA miRNA Inhibitors。可以看到，传统的miRNA Inhibitors的亲和力受GC含量和Tm值的高度影响，温度跨度为40°C。相比之下，miRCURY LNA miRNA Inhibitors的Tm值都集中在最佳高温周围的10°C区间内。 

2. miRCURY LNA miRNA Power Inhibitors ，摆脱转染试剂的限制。LNA与硫代磷酸酯修饰（PS)的结合，造就了更为高阶的miRCURY LNA miRNA Power Inhibitors，其更加耐受酶降解而具有更强的稳定性。此外，Power Inhibitors可被直接添加到含血清的培养基中，而不需要转染试剂即可进入细胞，特别适用于难以转染的细胞以及高表达的miRNA靶点。

Power inhibitors表现出更好的活性 

3.毒性小及避免脱靶效应。miRCURY miRNA Inhibitors 及Power Inhibitors的高效性使得它们可以在低浓度下使用。LNA能够有效抑制RNase H活性，确保LNA /RNA双链不被RNase H识别为底物，从而最大限度地减少对mRNA和lncRNA的脱靶效应。 

4. 可荧光标记，可用于体内实验。miRCURY miRNA Inhibitors可进行荧光标记，便于实验效率的监测，此外LNA的更短序列设计结合硫代磷酸酯修饰骨架，使其能够更好用于体内实验。

miRCURY LNA miRNA Power Target Site Blockers（TSB，靶点封闭剂）是一种LNA增强的反义寡核苷酸，它结合到mRNA的miRNA靶点上，通过将该位点“封闭”而阻止miRNA与该位点的结合，从而无法发挥相应的作用。这使得研究人员能够研究miRNA对单个靶标的影响。

LNA增强的靶点封闭剂与RISC有效竞争miRNA结合位点 

miRCURY LNA miRNA Power Target Site Blockers设计中LNA技术的引入，到使其能够更有效地与miRNA/RISC复合物竞争miRNA靶点，同样确保了反义寡核苷酸不会催化RNase H依赖性的mRNA降解。因此，miRCURY LNA miRNA TSB会通过阻止miRNA介导的翻译衰减而导致靶mRNA编码蛋白的表达增加。此外，与miRCURY LNA miRNA Inhibitors相同，miRCURY LNA miRNA TSB也能用于体内实验。 

以上便是QIAGEN针对miRNA功能研究提供的“三件套”解决方案，下期我们将继续围绕如何进行miRNA的空间定位展开介绍，敬请期待。欢迎关注“凯杰生命科学”，获取更多miRNA专业知识。 

参考文献

[1] Wang P, Zhou Y, et al. Effective tools for RNA-derived therapeutics: siRNA interference or miRNA mimicry. Theranostics. 2021;11(18):8771-8796. Published 2021 Aug 11.

[2] Bernardo BC, Ooi JY, et al. miRNA therapeutics: a new class of drugs with potential therapeutic applications in the heart. Future Med Chem. 2015;7(13):1771-1792. 

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