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细胞划痕实验作为检测细胞迁移能力的金标实验,应用非常广泛。其原理是在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕/伤口”,边缘的细胞接收到迁移信号会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程,又名伤口愈合实验(Wound-Healing Assay),广泛用于观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。 通过统计划痕面积(Scratch Area)随着时间的变化率以及伤口愈合百分比(Wound healing percentage)即可说明细胞迁移能力。所以,对于不同时间点下的细胞划痕面积进行量化就是必不可少的一步操作了。利用Image J对细胞划痕进行量化实质上就是简单的面积测量,但由于细胞迁移之后划痕变得不规则,如何获取这个不规则选区才是难点。细胞划痕实验中常用的获取选区的方法有查找边缘(find-edges)法,方差(variance)滤波法。需要注意的是,由于涉及多个时间点的照片拍摄,拍摄条件可能不一样,请注意添加标尺对实际面积进行校正,然后再进行测量。本教程没有找到合适的图片,就没有校正标尺了。具体校正方法见《Image J测量实际尺寸:设置和添加标尺》。下面先来看一下最常用的查找边缘(find-edges)法,然后在插件中看方差(variance)滤波法和查找边缘(find-edges)法。01查找边缘法1、打开图片之后,Image-Type-8 bit;![]() ![]() 第2步和第3步总的效果跟使用Process-Sharpen,然后Image-Adjust-Brightness/Contrast提高对比度差不多;个人认为第2步和第3步的目的是强化细胞边缘,便于与划痕(背景)区分开来,但往往会造成最后测量的划痕面积稍微偏小;大多数情况下可以不做,直接第4步就行,但是一系列图片中要么都别做,要么都做。不少教程都有这两步,这里稍作说明。 4、Process-Find Edges。这一步才是最重要的,也是“查找边缘法(Find Edges)”这个方法的名称来源,会通过二值化处理极大加强细胞和背景的对比,如果细胞的轮廓通过第2和第3步的强化,这步会更明显,如果没有强化也没太大关系;![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Variance filter radius(方差滤波器半径),要根据图片分辨率来设置,默认是10 px,主要是用来识别划痕边缘,越大计算越慢,而且会导致测量得到划痕面积偏小; Threshold(阈值):将由方差滤波器得到的图像转换为蒙版;如果调小一点选区会更精细,但会丢失掉一部分选区;调大一点,对于划痕区域识别会更准,但对边缘轮廓线会进行近似处理;具体可用之前查找边缘法中的threshold建立选区的操作体验一下。Radius open(空洞半径):可用来关闭组织中的不属于划痕的空洞,要比需要排除的孔大、比划痕小,这个值默认4一般是偏小的,但是也无所谓,因为下面一个参数会很好地过滤掉空洞。Min.size(划痕最小大小):划痕的最小大小,可以进一步排除除划痕之外的其他空洞,这个大小可以使用矩形工具对划痕建立选区后进行测量,大概估算而求得;ignore spatial calibration(忽略标尺校正):这里没有校正,选不选都无所谓;在做了标尺校正的时候,视情况而定是否需要,一般不勾选。 再次点击m图标,这回划痕面积会大一点,而且选区轮廓线也更贴近细胞一点;![]() ![]() 6、然后把打开的图片,改成8 bit:Image-Type-8 bit,点击m图标即可; ![]() http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool 03 Fiji软件下载鉴于有些同学说Fiji很难下载,下面我把Fiji的win64版和mac版放在了网盘里面,有需要的请自行下载。链接:https://pan.baidu.com/s/1JCEtW0jMwnB3mV6jiXlatw 提取码:xol8(请复制粘贴使用提取码,我知道你们分不清1和I和l) |
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