二代测序Miseq上机操作实验

Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）。通过单分子阵列实现在小型芯片（FlowCell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。读长在 100-150bp 之间，操作简介，数据质量高尤其是illumina高通量检测覆盖各个领域适用性高。

高通量测序、Miseq、测序技术

1. 样品信息

健康人的粪便样本

2. 试剂和耗材

    2.1 文库构建试剂：TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina

      货号 TR503

    注：根据需要选择适用于实验的试剂

    2.2 Miseq测序试剂：MiSeq Reagent Kit v3

       货号：MS-102-3003

注：根据需要选择适用于实验的试剂

    2.3磁力架：Invitrogen

3. 仪器和软件

    移液器：EPPENDORF  

    PCR仪：LabCycler Standard P

    定量仪：Qubit4.0

    质量评估：Agilng2100  G2938C

    上机测序：Miseq测序仪

Miseq建库定量上机

（一）、文库的定量、标准化和混合

    基于Qubit定量结果进行换算

    如：5ng/ul的Nana或Qubit定量结果，预估建库长度为500bp则，换算浓度为

    5/（660*500）*106 = 15.3nM

    根据计算结果，用10mM的Tris-HCl（pH 8.5）把文库稀释到终浓度为4nM。 

（二）、文库稀释

    测序前，混合文库会以NaOH进行变性，再用杂交buffer进稀释，当MiSeq测序前，再进行        热变性。对于低多态性的文库来说，每一个run中需要加入至5%的PhiX用作测序质控。

准备工作：

       1、800ul的水和200ul1N的NaOH。颠倒数次混匀。

       2、把Miseq的试剂盒从冻存冰箱里取出，在室温下解冻。

       3、准备一个冻桶，其中冰和水的比例为3：1。

DNA变性：

        1、将最终的文库和新配的NaOH混合：5ul的4nM混合文库，5ul的0.2N的NaOH

        2、在12小时以内，0.2N的NaOH与PhiX质控相混合，并保存。

        3、旋涡振荡后，短暂离心。

        4、室温静置5min，等DNA变性。

        5、向文库中加入预冷的HT1（杂交液）：10ul的变性DNA，990ul的预冷HT1

           结果是在1mM的NaOH中为20pM浓度的变性DNA文库，文库总量为0.02pmol。

        6、所得稀释液置于冰上。

稀释变性DNA

    1、变性DNA文库稀释到上机的终浓度。

当使用MiSeq v3时，原始簇（raw cluster）的密度是800-1000K/mm2。当第一次上机时，建议使用4pM的上机浓度，但可以随之调整。目前采用8pM。

    2、短暂离心后，把反应体系置于冰上。

    （三）、文库上机

        1、取出测序试剂盒，放置于常温水中（注意不要漠过上线）。静置60~90分钟，直至                  完全溶解。

        2、从水浴中取出试剂盒，上下颠倒十次混匀。擦干表面的水分。

        3、创建Sample Sheet。注：特别注意设置barcode

        4、开机，运行pre-Wash。约1小时。

        3、点击“Sequence”，按页面指示进行。

        1、Miseq上机操作过程中注意浓度换算

        2、Miseq测序当第一次上机时，建议使用4pM的上机浓度，后期逐渐增加，测序过                      程中  注意库检时小片段（100b以下）的量，如果小片段过多，上机浓度太大会爆                  掉，因为在测序过程中小片段先长到芯片上的。

        3、开始一个run前最好能配备一台UPS，以免测序过程中断电，这样损失比您买一个                  电池要大。

        4、测序仪要定期维护，尤其在计划开始测序前一定检查，以免全都准备好了，测序仪                  出问题了

作者：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，强裕俊，张雯，李秀文

实验视频：