抗体片段化

抗体是蛋白质和分子检测与纯化的强大工具。尽管完整抗体（通常是 IgG 或 IgM）适用于大多数免疫分析应用，但某些步骤的性能却通过使用抗体片段（例如 Fab 和 F（ab'）2）得到了增强。本文概述了制备抗体片段的优势、类型和方法。

有时，研究或利用免疫球蛋白的部分活性而不受其他分子片段的干扰，是非常有用的。可以选择性地将免疫球蛋白分子切割成具有离散特征的片段。使用还原剂和蛋白酶消化或切割免疫球蛋白蛋白质的部分结构，完成抗体片段化。尽管可以对所有免疫球蛋白类别进行片段化，但只有小鼠、兔和人 IgG 和 IgM 片段化的步骤得到了很好地表征。

两组主要关注的抗体片段是（a）抗原结合片段（例如 Fab）和（b）不结合抗原的可结晶片段（例如 Fc）。可以得到几种类型的抗原结合片段，但每种都至少包含重和轻免疫球蛋白链（分别为 VH 和 VL）的可变区，通常通过二硫键结合在一起以保留抗体结合位点。Fc 片段由免疫球蛋白的重链恒定区（Fc 区）组成，并介导细胞效应功能。

抗体片段化有点费力，需要优化酶介导的蛋白质消化，并且需要充足的抗体（例如 10 mg）来有效实现。因此，通常仅在可大量获得目标抗体且特定应用需要时才进行片段化。

抗体 IgG 结构和裂解位点的片段化。常用的抗体片段可通过还原铰链区二硫化物或通过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或无花果蛋白酶消化来制备，包括半 IgG、Fab、F（ab'）2 和 Fc。

抗体片段是整个抗体分子中的小型功能元件，与完整抗体相比，抗体片段在某些免疫化学实验技术和应用中具有多种优势：

F（ab'）2、Fab、Fab’ 和 Fv 是可以从 IgG 和 IgM 的可变区产生的抗原结合片段。这些抗原结合片段的分子量（MW）、化合价和 Fc 含量不同。Fc 片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区产生。这些片段和其他一些独特片段结构可以从五聚体 IgM 产生，包括“IgG”型片段、反向“IgG”型片段和五聚体 Fc 片段。

下图显示了典型 IgG 片段的名称（命名法）和结构，概述如下所示。

F（ab'）2（110,000 道尔顿）片段包含两个抗原结合区，通过二硫键在铰链处连接。该片段 Fc 区多数无效，但并非全部。

Fab'（55,000 道尔顿）片段可通过还原 F（ab'）2 片段形成。Fab’ 片段包含可以被烷基化或与酶、毒素或其他目标蛋白质结合使用的游离巯基。Fab’ 衍生自 F（ab'）2； 因此，可能包含一小部分 Fc。

Fab（50,000 道尔顿）是由 IgG 和 IgM 产生的单价片段，由通过分子内二硫键连接的 VH、CH1 和 VL、CL 区组成。

Fv（25,000 道尔顿）是由 IgG 和 IgM 产生的最小片段，包含完整抗原结合位点。Fv 片段具有与 Fab 相同的结合特性和相似的三维结合特性。Fv 片段的 VH 和 VL 链通过非共价相互作用结合在一起。这些链在稀释时趋于解离，因此已经开发了通过戊二醛、分子间二硫化物或肽接头使链交联的方法。

“rIgG” 是指还原的 IgG（75,000 道尔顿）或半-IgG。它是仅选择性地还原铰链区二硫键的产物。尽管 IgG 中存在几个二硫键，铰链区的最易还原，尤其当使用弱还原剂时，例如 2-巯基乙胺（2-MEA）。半 IgG 通常用于靶向暴露的铰链区巯基，通过抗体固定化或酶标记的方式靶向结合。

Fc（50,000 道尔顿）片段包含 CH2 和 CH3 区以及通过一个或多个二硫键和非共价键结合在一起的部分铰链区。Fc 和 Fc5µ 片段分别由 IgG 和 IgM 的片段产生。Fc 源自这些抗体片段的结晶化。Fc 片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区产生。Fc 片段不能结合抗原，但负责抗体的效应功能，例如补体固定。

免疫球蛋白单体（IgG）的铰链区非常容易受酶蛋白水解的影响。该位点的切割产生 F（ab'）2 或 Fab 片段以及 Fc 片段。Fc 片段根据所使用的酶和条件可保持完整或进一步降解。以下讨论了使用三种不同酶进行的蛋白水解 IgG 片段化。一般来说，蛋白水解是使用游离酶在溶液中完成的。我们开发了固定化酶产品，可以更好地控制消化并有效分离蛋白酶中的反应产物。因此，下图是指酶“树脂”。大多数操作步骤还包括蛋白 A 树脂抗体纯化步骤，用于分离 Fab 和 Fc 片段。

木瓜蛋白酶是一种非特异性巯基内肽酶，活性位点上含有巯基，必须在还原形式下才具有活性。当在还原剂存在的情况下将 IgG 分子与木瓜蛋白酶一起孵育时，铰链区的一个或多个肽键断裂，产生三个大小相似的片段：两个 Fab 片段和一个 Fc 片段（1）。当 Fc 片段为目标片段时，应选择木瓜蛋白酶，因为它可产生完整的 50,000 道尔顿 Fc 片段。

通过木瓜蛋白酶消化和片段化制备抗体 Fab。

木瓜蛋白酶主要用于生成 Fab 片段，但也可以用于生成 F（ab'）2 片段（2）。为了制备 F（ab'）2 片段，首先用 10mM 半胱氨酸激活木瓜蛋白酶。然后通过凝胶过滤去除过量的半胱氨酸。如果木瓜蛋白酶消化过程中不存在半胱氨酸，则可以生成 F（ab'）2 片段。这些片段通常不一致，并且可能存在重现性问题。如果半胱氨酸未完全清除，则可能会引起消化过度（2）。

结晶木瓜蛋白酶通常用于 IgG 消化。但是，它很容易自消化。可以使用比结晶木瓜蛋白酶更不易自消化的水银皂苷； 然而，这两种酶均属于未固定化的酶，都需要使用氧化剂来终止消化。固定化的木瓜蛋白酶（木瓜蛋白酶琼脂糖树脂）是一种优选试剂，因为它可轻松控制消化反应并在孵育后快速去除消化产物中的酶。因此，不需要开发用于分离酶片段的离子交换方法。固定化木瓜蛋白酶还可以防止形成抗体-酶加合物，当使用可溶性巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）时，会发生这种情况。当存在还原剂时，这些加合物可能不利于片段化。

固定化还增加了酶的稳定性，尤其是抵抗热变性和抵抗自溶的稳定性，使活性维持时间更长。木瓜蛋白酶树脂可再生和重新利用，降低了成本。可以通过消化时间或穿过色谱柱的流速调节裂解，得到可重现的消化物。我们的 Pierce Fab 制备试剂盒已针对消化人 IgG进行了优化。该试剂盒还可成功用于小鼠和兔 IgG 的消化，提供了有关如何更改方案用于其他种类 IgG 的建议。该步骤要求 IgG 能与蛋白 A 结合，因为它将用于从 Fab 片段中分离 Fc。

胃蛋白酶是一种非特异性内肽酶，仅在酸性 pH 下才有活性。在中性或碱性 pH 下发生不可逆变性。胃蛋白酶消化通常产生一个 F（ab'）2 片段和许多 Fc 小型肽段。得到的 F（ab'）2 片段由两个二硫键连接的 Fab 片段组成。Fc 片段大量降解，小型片段可通过透析、凝胶过滤或离子交换色谱与 F（ab'）2 分离。

通过胃蛋白酶消化和裂解制备抗体 F（ab'）2。

F（ab'）2 经略微还原可分离为两个含巯基的单价 Fab’ 片段。Fab’ 片段的优势在于可直接通过巯基与可检测标记物发生结合，从而确保活性结合位点不受阻碍并保持活性。使用 2-巯基乙胺·HCl（2-MEA）略微还原 F（ab'）2 片段。可以靶向结合每个 Fab’ 的游离巯基，或使用烷基化试剂（例如 N-乙基马来酰亚胺，NEM）进行封闭，防止重新形成 F（ab'）2。

固定化的胃蛋白酶（胃蛋白酶琼脂糖树脂）可以在任何分析应用中代替游离胃蛋白酶。胃蛋白酶树脂允许通过快速去除样品中的酶来停止反应而实现消化控制。消除了开发离子交换方法来分离片段与蛋白酶的必要。同样，固定化增加了胃蛋白酶抗热变性和自溶的稳定性，使活性维持的时间更长。我们的 Pierce F（ab'）2 制备试剂盒已针对人 IgG 消化进行了优化。该试剂盒还可成功用于兔和小鼠 IgG 消化。

无花果蛋白酶是一种硫醇蛋白酶，根据所含半胱氨酸的浓度将小鼠单克隆 IgG1 消化成 F（ab'）2 或 Fab 片段。无花果蛋白酶在 4mM 半胱氨酸存在的情况下生成 F（ab'）2。在 25mM 半胱氨酸存在的情况下生成 Fab 片段。

通过无花果蛋白酶消化和裂解制备小鼠 IgG1 Fab 和 F（ab'）2。

无花果蛋白酶剪切生成的 F（ab'）2 片段大小与采用胃蛋白酶从 IgG 中获得的片段大小几乎相同，但具有与完整 IgG1 抗体相当的免疫反应性和亲和力（3）。通过增加半胱氨酸激活剂的浓度产生 Fab 抗原结合片段（4）。无花果蛋白酶消化的中性 pH 条件有助于保持所得抗原结合性片段的完整性。无花果蛋白酶是产生鼠单克隆 IgG1 片段的首选蛋白酶。尽管可以使用预活化的木瓜蛋白酶从小鼠 IgG1 生成 F（ab'）2（5），但很难通过木瓜蛋白酶获得高效和重现性结果（6）。

固定化的无花果蛋白酶（无花果蛋白酶琼脂糖树脂）比游离的无花果蛋白酶能够更好地控制消化反应，因为它可产生不含自消化产物的抗体片段。此外，无花果蛋白酶树脂允许从抗体片段产物中完全、快速地去除无花果蛋白酶。我们的 Pierce IgG1 Fab 和 F（ab'）2 制备试剂盒开发用于从完整鼠 IgG1 抗体中温和生产和纯化 Fab 或 F（ab'）2 片段。得到的片段类型受消化过程中所用半胱氨酸激活剂特定浓度的控制。

IgM 的尺寸较大，为体外实验分析带来挑战。例如，完整 IgM 不能有效穿透组织进行免疫组织化学研究。因此，有必要为这类分析制备较小的活性片段。此外，由于 IgM 分子难以渗透细胞膜，因此对于体内研究来说不甚理想。与完整 IgM 相比，清除碎片的速度更快。

IgM 功能与 IgG 产生的 F（ab'）2、Fab'、Fab 和 Fv 片段几乎相同。但是，与 IgG 中的抗原结合位点相比，IgM 中的单个抗原结合位点通常具有较低的结合亲和力，通常在完整 IgM 中以五聚体形式得到补偿。因此，由于 F（ab'）2 片段是二价的，对于低亲和力抗体来说，它们可作为 Fab 片段的替代品。F（ab'）2 片段的亲和力高于 Fab 和 Fab’ 片段。F（ab'）2 片段可以沉淀抗原。Fab 和 Fab’ 是不能沉淀抗原的单价分子。Fab 和 Fab’ 片段的结合强度降低，在某些应用中，稳定的抗原-抗体复合物通常可能会在洗涤过程中发生解离。

IgM 抗体片段的制备方法。

每种 IgM 对酶促裂解和还原的反应不同。例如，小鼠和人的 IgM 将单体连接成五聚体结构的方式不同，这主要是由单体之间二硫键的位置不同所致（7）。同样，不同物种之间，可能阻碍酶裂解的寡糖组分不同。因此，一种物种的最佳消化和还原条件可能对另一种物种无效。

蛋白水解酶对 IgM 的片段化与 IgG 的片段化不同。这些变化与结构差异有关。重（µ）链折叠成多个球状结构域，并且 IgM 具有富含碳水化合物的 Cµ2 结构域，取代了 IgG 富含脯氨酸的铰链区。由于这些特征，木瓜蛋白酶从 IgM 产生异质性片段。

胃蛋白酶（见上文讨论部分）可用于从 IgM 产生 F（ab'）2、Fab 和 Fv 片段。已经开发出许多使用胃蛋白酶来获得不同物种 IgM 片段的方法（8）。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在 pH 8.0 时反应最佳。通常，增加酶与底物的比率和/或温度将增加消化速率。胰蛋白酶可从 IgM 产生 F（ab'）2、Fab、“IgG”型和 Fc5µ 片段。使用胰蛋白酶（对尿素进行预处理和不进行预处理）对裂解进行了研究（8）。尿素改变了结构域对消化的敏感性，产生与经过水性缓冲液消化的不同片段。已经开发出许多其他使用胰蛋白酶消化 IgM（9）的方法。

可以根据还原时间和/或温度，使用 2-巯基乙胺·HCl（2-MEA）控制还原反应，获得不同比例的“IgG”型和/或还原 IgG（“rIgG”）（10）。部分还原小鼠 IgM 也可产生反向“IgG”型片段。