基因敲除HPV16 E7

聚（β-氨基酯）546和治疗质粒构成的纳米颗粒对宫颈癌细胞生长的在体内外的抑制作用

研究人员设计了3个靶向HPV16 E7的sgRNAs（用红棉CRISPR基因编辑系统设计），并构建了CRISPR/Cas9质粒（由源井生物提供）。用NPs（PBAE546/质粒60:1）处理HPV16-阳性细胞（SiHa、CaSki和S12）和HPV16-阴性细胞（HeLa）6个小时，并在24h，48h和72h时用CCK-8法检测细胞活性。与空质粒的对照组相比，三个NPs都有效地降低了HPV16-阳性细胞活性(图1A-C)，但没有观察到HPV16-阴性HeLa细胞活性的差异。为了进一步研究NPs对体内肿瘤生长的抑制作用，在裸鼠皮下接种SiHa细胞，当异种移植肿瘤增长大约35mm3时，肿瘤内注射NPs进行治疗。根据体外细胞系实验的结果，筛选出sgRNA2对细胞活性的抑制作用最好。每4天注射一次，持续20天。在SiHa皮下肿瘤小鼠中，与空质粒对照组相比，CRISPR-敲除HPV16 E7组肿瘤生长遭到显著抑制，肿瘤体积显著减小（图2），而在HeLa皮下肿瘤小鼠中，两组间无差异。

源井在这个实验中构建了靶向HPV16 E7的CRISPR质粒和对照质粒YKO-RP003-Ctrl，同时利用红棉CRISPR基因编辑系统智能设计了gRNA序列。基于数千个基因编辑成功案例与独家开发的精确算法，红棉CRISPR基因编辑系统能轻松实现基因敲除细胞方案与gRNA序列的自动化设计。欢迎前往公 众 号：源井生物了解更多。

图1

图2

敲除HPV16 E7的纳米颗粒对HPV16转基因小鼠子宫颈蛋白表达的影响

为了更接近宫颈癌初步的临床位置，并寻求非侵入性处理，研究人员使用HPV16转基因小鼠通过阴道给药进行宫颈原位治疗。持续治疗20天后，NPs组小鼠宫颈上皮的恶性表型明显逆转。上皮细胞增殖受到抑制，基底细胞排列整齐，细胞核体积减小。对照组小鼠的宫颈上皮细胞明显增生(图3A)。用免疫组化技术检测HPV16 E7及其相关蛋白的表达水平。首先，靶分子HPV16 E7和HRHPV感染替代标记物P16的表达显著降低，而与E7癌蛋白相互作用的抑癌基因RB1的表达得以恢复。第二，增殖相关蛋白Ki67和CD34、细胞周期相关蛋白CDK2、转录因子E2F1的表达明显受到抑制(图3B)。这些结果表明，靶向敲除HPV16 E7的NPs可以有效降低靶基因癌蛋白的表达，影响相关信号通路，从而逆转HPV16转基因小鼠的宫颈上皮细胞恶性表型。

图3

总之，他们开发了由PBAE546和CRISPR/Cas9组成的NPs用于治疗HPV感染。这些NPs稳定，且在酸性的阴道中具有良好的转染效率，因此非常适合作为阴道药物。NPs通过靶向敲除E7可以有效地使HPV无效。因此，这种NPs可以在未来以阴道洗液和凝胶的形式用于治疗宫颈炎和CIN。该研究为纳米医学治疗宫颈病变的临床转化，从而预防宫颈癌提供了新的希望。返回搜狐，查看更多