碧云天

使用说明： 对于用镍柱纯化大肠杆菌中His标签蛋白比较熟悉的使用者可以直接参考“6. 简化的操作流程”。否则请参考如下详细内容： 如下以最常见的大肠杆菌中表达纯化His标签重组蛋白为例，说明本产品的使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，并借鉴大肠杆菌中纯化His标签重组蛋白的使用说明。 1.大肠杆菌中His标签重组蛋白的诱导表达： 如下以最常用的IPTG诱导表达系统给予说明，诱导表达条件的优化请参照所使用的诱导表达体系的详细说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。 a.挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。 b.按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37℃并含适当抗生素的LB培养液中。例如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37℃并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。 c.37℃常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。 d.加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。 注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。 e.收集菌液至离心管中，4℃ 4,000g离心20min或4℃ 15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20℃或-80℃冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。 2.非变性条件下His标签蛋白的小量纯化： 本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。 a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl非变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。 注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200µl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40µl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本非变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。 b.加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。 注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。 c.轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。 d.4℃离心(15000g×10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。 e.加入20µl混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。 注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。经测试，直接使用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也能获得良好的纯化效果。但如果希望获得更高的标签蛋白得率，可以预先用一个柱体积的非变性裂解液平衡BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) 2-3次。平衡后，视不同的待纯化蛋白而定，待纯化蛋白的得率有可能会提高约5-20%左右。 f.4℃离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。 g.加入100µl非变性洗涤液重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。 h.重复步骤g，再进行一次洗涤。 i.加入20µl非变性洗脱液，轻轻重悬凝胶。4℃离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化获得的带有His标签的目的蛋白。 j.重复步骤i两次。共洗脱收集约60µl纯化的蛋白样品。 3.非变性条件下His标签蛋白的大量纯化： a.接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml (2-5ml均可)非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。注：后续试剂用量均按照1克菌重和4ml裂解液用量进行。 b.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。 注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。 c.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。 注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。 d.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。 e.4℃ 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。 注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。 f.取1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。 注：BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也可以不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能会有5-20%的下降。 g.将裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。 注：也可先取1ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱，然后用0.5ml非变性裂解液平衡2-3次后加入约4ml细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些。 h.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20µl穿流液作后续分析用。 i.洗柱5次，每次加入0.5-1ml非变性洗涤液，每次均收集约20µl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。 注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。 j.洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。蛋白纯化效果可以参考图1。

图1. 非变性条件下His标签重组蛋白纯化效果图。M: marker (P0076); CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：非变性裂解液洗涤1-3 (wash 1-3)；W4-W8：非变性洗涤液(非变性裂解液添加20mM咪唑)洗涤4-8；E1-E4：洗脱液(非变性裂解液添加250mM咪唑)洗脱1-4 (elution 1-4)。注：实际的电泳结果会因样品、上样量等的不同而有所不同。

4.变性条件下His标签蛋白的小量纯化： 本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。 a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100μl变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。 注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，含尿素裂解液裂解后可以直接用于SDS-PAGE，含盐酸胍的裂解液裂解后需透析除去盐酸胍才可用于SDS-PAGE。 b.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。 c.4℃离心(15000g×10min)，取10μl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。 d.加入20μl混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃在摇床上缓慢摇动30min，以充分结合带His标签的目的蛋白。 注：缓慢摇动30min已经可以确保蛋白充分结合，但可以根据时间安排的需要缓慢摇动更长时间甚至缓慢摇动过夜。经测试，直接使用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也能获得良好的纯化效果。但如果希望获得更高的标签蛋白得率，可以事先用一个柱体积的变性裂解液平衡BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)2-3次。平衡后，视不同的待纯化蛋白而定，待纯化蛋白的得率有可能会提高约5-20%左右。 e.4℃离心(1000g×10s)沉淀凝胶，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。 f.加入50μl变性裂解液重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)，取20μl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。 g.重复步骤f，再进行一次洗涤。 h.加入20μl变性洗脱液，轻轻重悬凝胶。4℃离心(1000g×10s)，收集上清及凝胶。上清即为纯化的带有His标签的目的蛋白。 i.重复步骤h两次。共洗脱收集约60μl纯化的蛋白样品。 5.变性条件下His标签蛋白的大量纯化： 接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每1L表达菌加入80ml变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。 a.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理2s，每次间隔2s，共超声处理15-30min。 注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。 b.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。 c.4℃ 10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μl上清留作后续检测用。 注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。 d.取适量混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。 e.按照每0.5ml凝胶(相当于1ml 50%的凝胶)中加入4ml细菌裂解液上清的比例(1:8)，混合BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)和细菌裂解液上清。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。 f.将裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的混合物装入适当的空柱管中，如碧云天的亲和层析柱空柱管。 注：也可先装柱，用1倍柱体积的变性裂解液平衡后加入细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合。 g.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20µl穿流液作后续分析用。 h.洗柱5次，每次加入0.5-1ml裂解液，每次均收集约20µl穿柱的裂解液用于后续的分析检测用。洗柱及后续的洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。 注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。 i.再次洗柱5次，每次加入0.5-1ml变性洗涤液，每次均收集约20µl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。 注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。 j.洗脱目的蛋白5-10次，每次用0.5ml变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。蛋白纯化效果可以参考图2。

图2. 变性条件下His标签重组蛋白纯化效果图。M：marker (碧云天P0076)；CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：变性裂解液洗涤1-3；W4-W8：变性洗涤液洗涤；E1-E4：洗脱液1-4。注：实际的电泳结果会因样品、上样量等的不同而有所不同。

6.简化的操作流程： a.细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌。根据待纯化蛋白的溶解性，选择非变性或变性条件进行纯化。 b.每克细菌沉淀湿重加入4ml裂解液，可添加适量蛋白酶抑制剂，充分重悬细菌。 c.冰上超声裂解细菌，离心取上清。非变性条件下可以先使用溶菌酶处理，然后再进行超声处理。 d.BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)装柱，1ml裂解液平衡纯化柱2次。 e.步骤6c中的上清上柱。 注：上清上柱是可以收集穿流液并重复上柱3-5次，以充分结合His标签蛋白。 f.非变性条件下，用0.5-1ml洗涤液洗柱5次。变性条件下需要先使用0.5-1ml裂解液洗涤5次，然后再使用0.5-1ml洗涤液洗柱5次。 注：如果出现咪唑浓度偏低的情况，可以自行添加适量咪唑，如果出现咪唑浓度偏高的情况，可以使用试剂盒提供的裂解液作为洗涤液使用。 g.用0.5ml洗脱液洗脱6-10次。 注：通常该洗脱条件会比较理想。如果出现洗脱效果欠佳的情况，可以自行在洗脱液中额外加入250mM的咪唑。 常见问题： 如果纯化不成功，可以对纯化过程中收集的每个组分进行SDS-PAGE电泳检测，分析其原因。 1.蛋白无法与BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)结合 a.测序检查基因序列的读码框是否正确。 b.尝试将标签加在蛋白的另一端。 c.增加BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)与蛋白结合时间(如4℃过夜)。 d.如果使用预装柱，可收集裂解液上柱后的穿流液并多次重复上柱。 e.检查所有缓冲液和溶液的pH值是否正确。 f.确认体系中所用各种试剂的浓度在镍柱的耐受范围以内。 g.自行配制裂解液，降低裂解液中的咪唑浓度。 2.目的蛋白被洗涤液洗脱 a.自行配制洗涤液，降低洗涤液中的咪唑浓度或者稍微提高其pH值。 b.检查洗涤液的pH和成分。 c.确认洗涤液中各种试剂的浓度在耐受范围内。 3.蛋白在纯化过程中形成沉淀 a.将纯化温度控制在室温。 b.加入去垢剂，如0.1% Triton X-100或者Tween-20。 4.蛋白无法洗脱 a.用梯度pH及咪唑洗脱，确定最优洗脱条件。 5.目的蛋白与其它蛋白共同洗脱 a.提高裂解液和洗涤液中的咪唑浓度。 b.降低BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的使用量。 c.增加盐或者去垢剂浓度，或者向洗涤液中加入乙醇或甘油以降低非特异相互作用。 d.检查基因内部是否含有起始密码子(C端标记蛋白)或者提前终止位点(N端标记蛋白)。 相关产品：