在自然繁殖和辅助生殖过程中维持遗传的完整性

参考文献：本文引用自“在自然繁殖和辅助生殖过程中维持遗传完整性(Maintenance of genetic integrity during natural and assisted reproduction)”，作者是约翰·麦卡瑞;德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物系，美国德克萨斯州圣安东尼奥。

John McCarrey博士是德克萨斯大学圣安东尼奥分校细胞和分子生物学教授，也是圣安东尼奥细胞和分子灵长类动物学研究所所长。在加州大学戴维斯分校获得学士、硕士和博士学位后，他在加利福尼亚州杜阿尔特的希望之城与 Susumu Ohno 博士一起进行了博士后研究。McCarrey博士发现了人类基因组中功能性生殖细胞特异性逆转座子的第一个例子。他发表了几篇关于表观遗传编程机制的论文。McCarrey博士目前的研究兴趣集中在哺乳动物生殖细胞和干细胞的发育，分化和功能。

繁殖的本质涉及遗传信息从父母传播给后代。在哺乳动物中，生殖系细胞中自发获得突变的频率低于体细胞，这反映了种系细胞在遗传信息传播中的作用以及维持这些细胞遗传完整性的重要性。蓝色巨人®转基因小鼠模型用于研究以下各项的频率和频谱：(i)生殖细胞在小鼠生命周期中自然发育时的自发点突变;(ii)在自然和辅助生殖过程中通常从父母传播给后代的获得性突变。研究发现，生殖细胞通常保持自发点突变的频率比在同一个体的体细胞中观察到的频率低5-10倍，导致下一代胚胎的点突变频率非常低。在自然受孕胎儿和辅助受孕胎儿之间突变的频率或谱度方面没有观察到显着差异，这表明在维持遗传完整性方面，这些方法是安全的。对体细胞核移植产生的胎儿的初步分析表明，遗传完整性的维持受到表观遗传机制的组织特异性调节，这些机制在克隆过程中会受到重编程的影响。

辅助生殖技术(ARTs)现已为全球>3万婴儿的出生做出了贡献，但对这些方法的安全性仍然存在担忧。我们使用转基因小鼠模型来检查ARTs对自然繁殖或各种ART方法(包括植入前培养，胚胎移植，体外受精，卵胞浆内单精子注射和圆形精子注射)产生的中期小鼠胎儿点突变的频率和谱的影响。我们的结果表明，在自然受孕的胎儿和体外受精、卵胞浆内单精子注射或圆形精单体注射产生的胎儿中发现的从头点突变的频率或谱没有显着差异。基于对转基因小鼠系统的分析，这些结果表明，在维持遗传完整性方面，ART似乎是安全的。

自1978年通过体外受精(IVF)受孕的第一个成功的“试管婴儿”Louise Brown出生以来(1)，估计有>3万婴儿通过应用某种形式的辅助生殖技术(ART)(www.medicalnewstoday.com/medicalnews.php?newsid = 45720).ARTs为全世界数十万不孕夫妇的治疗提供了新颖的解决方案。胚胎移植(2，3)，卵胞浆内单精子注射(ICSI)(4)，睾丸精子提取显微外科手术(5，6)和圆形精子注射(ROSI)(7)的出现进一步扩大了ARTs现在提供的不孕症的范围。因此，这些方法现在占大多数西方国家新生儿的1-2%(8，9)，在某些国家(如丹麦)占出生人数的6%(10)。随着抗逆转录病毒治疗方法的不断技术进步和寻求不孕症治疗的个人人口结构的变化，这一数字可能会继续增加。

尽管ART取得了显著的成功，但人们仍然担心这些方法的安全性。先前的研究表明，ARTs与表观遗传编程的潜在破坏之间存在关联，如与基因组印记缺陷相关的疾病登记库中的ART衍生儿童的发病率高于平均水平，例如Angelman综合征(11)，Beckwith-Weidemann综合征(12-14)和视网膜母细胞瘤(15).此外，对小鼠的研究表明，在血清存在下培养植入前胚胎与印记基因(16，17)表达异常增加和胎儿发育障碍导致小后代(17，18)以及某些行为异常的发生率增加有关(19)。

尚未彻底调查的一个潜在关注领域是，使用ARTs可能会引入新生遗传畸变，这将表现为由此产生的后代突变频率的增加和/或突变谱的变化。以前的研究已经产生了不一致的证据，证明ART衍生的儿童核型异常的风险增加，而不是通常与父母的年龄或其他易感史相关的风险(20，21)。Munne等人(22)对人类胚胎的一项研究得出结论，ICSI不会比传统的IVF产生更多的数字染色体异常。在对小鼠胚胎的研究中，Bean等人(23)发现培养条件的改变可能对ART衍生的胚胎的遗传质量产生相当大的影响。然而，核型仅揭示最严重的遗传畸变，包括染色体物质的倍性异常或非常大的缺失、重复或重排。这排除了对最常见的遗传畸变的任何评估，统称为点突变，包括单碱基替换，或小的缺失、插入或重排。据估计，点突变是人类大多数遗传疾病的原因(24)，因此，它代表了一类明显值得研究的突变。

对人类ART衍生后代中的点突变进行全球分析是不切实际的，因为任何一个位点的新生突变通常仅以1/10，000-1，000，000个基因组的频率发生(25)。因此，我们使用了专门设计的转基因小鼠模型，以促进对罕见点突变的频率和光谱的分析。来自Stratagene(加利福尼亚州拉霍亚)的Big Blue转基因小鼠作为集成转基因携带λ噬菌体穿梭载体，可以从基因组DNA中选择性地回收，包装成传染性噬菌体颗粒并通过比色测定进行筛选，以在该基因基本未突变拷贝的背景中检测细菌lacI基因的罕见突变拷贝(26).此外，携带突变转基因的噬菌体DNA可以被扩增和测序，以确定构成任何单个突变的碱基序列的确切变化。使用这种方法，可以检查报告基因转基因以确定点突变的频率和频谱。我们已经使用该系统来确定基于ART的生殖方法是否在妊娠中期胎儿中点突变的频率或频谱上引入了与自然生殖产生的胎儿相比的任何相对差异。

讨论

对ARTs使用的一个持续关注是这些程序可能在多大程度上破坏自然发生的过程，特别是与指导适当的胚胎和胎儿发育所需的动态重编程相关的过程。表观遗传编程的动态变化通常发生在配子发生过程中的雄性和雌性种系基因组中，以及由此产生的胚胎基因组中，并延伸到整个胎儿发育过程中。已有证据表明ART可能破坏表观遗传编程机制(11-19)。然而，此外，生殖过程中的遗传参数也发生了变化，特别是在生殖细胞和胚胎中获得性突变的频率方面。已经表明，成熟精子携带的获得性突变比来自同一个体的体细胞少5至10倍(33)，初步结果表明，女性生殖细胞和体细胞突变的频率存在类似的差异(P.M.和J.R.M.，数据未显示)。配子基因组传递的获得性突变的低频率产生具有类似低频率突变的初始胚胎基因组。然而，随着发育的进行，新生突变的积累相对较快，我们发现突变频率为≈1(×10−5)在10.5 dpc的自然受孕和妊娠胎儿中。

在这里描述的研究中，我们研究了各种不同类型的辅助生殖技术对最终胎儿点突变的频率和频谱的影响。这种分析必须在动物模型系统中进行，因为在人类受试者中没有类似的分析是可行的。此外，这项研究的优点是被设计为对完全可育人群的前瞻性实验分析，从而消除了经常混淆人类案例研究的不孕不育或低生育力变量。ARTs有几个方面可能是诱变的。这些包括配子和胚胎的物理操作的直接影响和/或进行这些操作的离体环境的影响。通过比较源自自然受孕和妊娠的中期妊娠胎儿突变的频率与在植入前部分时间的自然交配后体外培养并随后转移到代孕女性以促进发育到中期产生的胎儿的频率，我们发现这些程序不会导致从头发生任何增加 点突变。这表明，通常在植入前胚胎中维持遗传完整性的机制(例如，DNA修复活动)在正常发育期间维持在雌性道中的胚胎或在体外发育期间在培养中维持的胚胎中功能相似。这些结果进一步表明，在体外培养的哺乳动物胚胎中，维持遗传完整性比维持表观遗传完整性更严格，因为我们没有观察到前者的缺陷，而后者的缺陷已被报道(11-19)。

体外受孕为诱变提供了额外的机会，因为每种方法都需要操纵配子。ICSI和ROSI都需要使用独特的物理操作，分别可能损害精子或精子，以及注射它们的卵母细胞。这可能导致核酸或其他细胞成分(包括核酸酶)的亚细胞区室化被破坏，如果获得基因组DNA，可能会导致突变。或者，这种操作可能通过导致细胞内离子浓度的变化而产生二次诱变作用，从而激活内源性核酸酶或抑制配子或胚胎中的内源性DNA修复活性。然而，我们对IVF，ICSI或ROSI产生的中期妊娠胎儿的分析表明，这些方法不会改变最终胎儿中点突变的频率或频谱。

我们确实观察到每种ART方法产生的存活到妊娠中期的移植胚胎比例的差异。因此，目前正在对与各种抗逆转录病毒治疗程序相关的差异发育效率进行扩展研究(Y.Y，L.C.，R.Y.和J.R.M.，数据未显示)。然而，出于本研究的目的，我们专注于10.5 dpc的活胎儿的突变频率，因为存活到妊娠中期的胎儿中有很大一部分通常会进入足月，并且专门针对这类胎儿，我们希望评估ART方法对诱变的任何潜在贡献。

从理论上讲，表观遗传编程的破坏可能导致随后的诱变事件，要么通过改变胞嘧啶的甲基化状态，可能导致C / G-to-T/A转换频率的变化，或者通过破坏DNA修复基因的调节，这对于正常维持遗传完整性至关重要。然而，我们没有观察到ART产生的胎儿遗传完整性的这种改变。这包括在惠顿的培养基中培养植入前胚胎没有任何效果，这先前被证明在一定程度上破坏表观遗传编程(17，19)。

关于遗传完整性的评估，区分遗传突变和新生突变很重要。父母任何一方种系基因组中存在的遗传缺陷同样有可能通过自然或辅助生殖作为遗传突变繁殖给后代(34)。我们的研究特别侧重于评估新获得的新生突变的发生率，以确定ART程序是否直接产生新的点突变。我们发现，在自然受孕和妊娠产生的中期胎儿中，新生点突变通常以相对较低的频率发生，我们对IVF，ICSI或ROSI产生的胎儿的分析表明，由于应用ART程序，这些突变的频率和频谱保持不变。因此，我们得出结论，关于维持遗传完整性，如从头点突变的频率或频谱所示，ART方法似乎是安全的。

方法：小鼠

所有涉及活体动物的程序均事先得到夏威夷大学机构动物护理和使用委员会的批准。C57BL / 6背景(26)上的lacI转基因纯合子“蓝色”雌性(Stratagene)用于自然交配并作为成熟未受精卵母细胞的来源。野生型(非转基因)DBA/2雄性(NCI)用于自然交配，并作为精子和圆形精子的来源。先前与同一菌株的输精管切除雄配的野生型CD-1雌性(Charles River)作为代孕母亲。所有动物均在空调房中饲养，调节明暗循环(14小时亮/10小时黑暗，从每天上午6：00开始)。

媒体

补充葡萄糖的碳酸氢盐缓冲CZB培养基(27)或补充EDTA(WM)(29)的惠顿培养基用于在37°C的5%CO中培养胚胎2在空气中。卵母细胞的操作是在室温(33°C)下在23%空气中在Hepes缓冲的CZB(Hepes-CZB)(100)中进行的。TYH培养基(36)用于体外精子获能和受精。

体外自然受精胚胎的自然交配和培养

自发性发情的“蓝色巨人”雌性与DBA / 2雄配。交配后的第二天(=阴道塞的那一天)被认为是怀孕的第0.5天。在自然交配后的第二天从输卵管中收集已达到原核阶段的受精卵母细胞，并在CZB中培养1天以获得2细胞胚胎，或在CZB或WM中培养3天以获得桑葚/囊胚胚胎。

体外配子或胚胎的操作

对于IVF，将从成年DBA / 2雄性小鼠的附睾尾部收集的精子在TYH培养基中孵育1-2小时。如所述，将少量获能的精子悬浮液加入到含有新鲜排卵卵母细胞的TYH培养基中(35)。1至3小时后，将原核阶段的受精卵母细胞洗涤并在CZB中用葡萄糖在5%CO中培养-天24-5小时后在空气中;在一滴培养基中一起培养10-20个胚胎。ICSI和ROSI按照木村和柳町(36，37)的描述进行，除了在ICSI期间将分离的精子头而不是整个精子注射到卵母细胞中(38)，并且用于ROSI的卵母细胞通过4-5小时用10mM SrCl处理激活2在不含钙和镁的CZB培养基中。

胚胎移植

将2细胞或桑葚/囊胚阶段的胚胎转移到胚胎移植前一天晚上通过与输精管切除的雄配而假怀孕的雌性的输卵管中;将5-7个胚胎转移到每个受体雌性的一个输卵管中。移植日被认为是怀孕的第0.5天，因为无论移植的胚胎处于哪个阶段，小鼠胚胎的植入都发生在4.5 dpc。随后从代孕母亲的子宫中以10.5 dpc恢复转移的胚胎。

试验设计

对于每种受孕方法，胚胎或胎儿都是从五对独立的父母中收集的。在每种情况下，父亲都来自DBA2菌株，而母猪来自携带lacI转基因的C57BL / 6菌株。除非另有说明，否则从每对亲本中分析相同数量的胚胎。根据在开始这些实验之前进行的计算，每个类别至少检查了2万个斑块形成单位(pfu)，表明该数字将产生0.80的功效，以检测突变频率从基线频率2.1×2的10倍变化−5.检查了中期妊娠胎儿，因为这是受精后的最早阶段，可以提供足够数量的细胞，因此可以提供足够数量的PFU，以促进对单个胎儿的分析。没有检查后期阶段，因为我们希望将分析重点放在植入前阶段受孕和/或操作方法的直接影响上，以最大程度地增加。

回收高分子量DNA

根据制造商的建议(Stratagene)，使用RecoverEase DNA分离试剂盒从10.5个正常大小和形态的dpc胎儿中分离出高分子量基因组DNA，并进行以下修改。将每个冷冻胎儿重悬于50μl冰冷的裂解缓冲液中，并转移到2ml Kontes(新泽西州Vineland)弹跳组织匀浆器中，并用柱塞“B”缓慢匀浆≈5次，然后用柱塞“A”再匀浆5次。将匀浆转移到装有1μm密理孔(Billerica，MA)过滤器的5.100ml微量离心管中，并短暂旋转以过滤匀浆。除去过滤器后，将管在13°C下以200，15rpm离心4分钟，除去上清液，并将沉淀重悬于10μlRNace-it(Stratagene)核糖核酸酶混合物(1μlRNace-it/49μl消化缓冲液)中并在50°C下孵育5分钟;然后将20μl蛋白酶K溶液(预热至2°C的0.50mg / ml)加入管中，然后在50°C下孵育≈1.5小时。然后将50μl1×TE加入每个样品中，然后使用漂浮在0ml 025×TE [500.1M Tris·HCl + 0.01 M EDTA (pH 0.1)]在室温下保存8天。

突变频率分析

根据制造商的说明，使用Transpack包装提取物(Stratagene)从基因组DNA中回收含有lacI靶标的λ穿梭载体。将包装好的噬菌体与SCS-8大肠杆菌细胞(Stratagene)混合，并以每17×500cm NZY琼脂测定托盘≤25，25 pfu接种。在 37°C 下孵育 16-18 小时后，通过蓝色鉴定突变斑块，计数、去核并在新鲜的 X-gal/NZY 平板上重新铺板以确认和纯化显示 lacI 突变表型的噬菌体。从每个胎儿或胎儿池中包装和分析至少三个单独的等分试样。每个DNA样本至少筛选300，000个pfu，每种繁殖方法至少分析2万个pfu。在调整“累积突变”(见下面的解释)后，通过将已确认的独立突变斑块的数量除以斑块形成单位的总数来确定最终突变频率。

突变谱分析

分离的突变噬菌体样品被送到加拿大维多利亚大学的CBR DNA测序设施进行序列分析。在每种情况下，使用15μl等分试样的噬菌体原液(储存在SM缓冲液中的核心突变斑块)作为PCR扩增2，114-bp片段的模板，包括lacI基因[引物：lacI AF(-285至-259)，5′-AACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTC-3′;和lacI AR(1829至1808)，5′-TCCAGATAACTGCCGTCACTCC-3′]。每个PCR产物使用LI-COR长读IR 4200 DNA测序仪通过循环测序[引物：lacI SF(-243至-211)，5′-TGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGC-3′(IRDye700标记)]进行测序;和lacI SR(1344至1328)，5′-CCAGCTGGCGAAAGGGG-3′(IRDye800标记)]，使用SequiTherm EXCEL II DNA测序试剂盒-LC(威斯康星州麦迪逊市Epicentre)根据制造商的说明。使用e-Seq v3.0碱基调用软件(LI-COR，Lincoln，NE)和SeqMan II v6.1分析软件(DNAStar，麦迪逊，WI)分析序列。

突变噬菌体中的lacI基因序列与野生型lacI基因序列的比较揭示并确认了每个单独的突变。突变被分类为转换(嘧啶到嘧啶或嘌呤到嘌呤的替代)，转位(嘧啶到嘌呤的替代，反之亦然)或小的插入或缺失。

除了提供突变谱数据外，对每个突变噬菌体进行测序还使我们能够识别“大奖”突变。累积奖金突变是指在同一样本中多次检测到的突变(即在同一位置的碱基序列的相同变化)(39-41)。假设突变随机发生，并考虑到新突变的典型频率，同一突变不太可能在同一样本组织中独立发生多次，因为这种发生的频率将由单个突变的频率乘积来描述。因此，当在单个样本中多次检测到相同的突变时，假设突变发生在该组织发育的早期，随后传播到组织中相对较大部分的细胞，这被称为大奖突变(39-41)。这种突变被计为单个确认的独立突变，无论它们从单个胎儿中恢复的次数如何(39，42-44)。

统计分析

通过泊松回归模型分析突变频率数据，并通过最大似然法(45)获得参数估计值。差异的统计检验使用似然比检验。所有计算均使用SAS PROC GENMOD软件(版本9.1;SAS研究所，北卡罗来纳州卡里)。使用χ2测试独立性。由于预期频率较低，因此计算了确切的 P 值(使用 SAS 版本 9.1)。

DNA甲基化分析

根据制造商的说明，通过使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)进行来自每个胎儿的2μg基因组DNA的亚硫酸氢盐转化。然后通过PCR扩增亚硫酸氢盐转化的基因组DNA(引物：bislacIF，5′-AGAGAGTTAATTTAGGGTGGTGAA-3′;和bislacIR，5′-ACAACTTCCAACAAACATC-3′)，并根据制造商的说明将产物克隆到Topo T / A克隆载体(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。通过使用Wizard SV minipreps试剂盒(Promega，麦迪逊，威斯康星州)制备质粒DNA，并对包括DNA结合结构域(+4至+444)并包含42个CpG位点(46，47 ) 在 ABI 3100 Avant 测序仪(应用生物系统，加利福尼亚州福斯特城)上按照制造商的说明进行操作。通过比较亚硫酸氢盐转化和未处理的DNA序列来确定每种CpG二核苷酸的甲基化状态。

结果

为了确定中期小鼠胎儿中新生突变的正常频率，我们从自然受孕和自然妊娠产生的转基因胎儿中回收了DNA[即，在后10.5天直接从子宫中恢复的内源性胎儿(dpc)]，并测量了lacI报告基因转基因突变的频率。为了检查植入前胚胎的体外培养和胚胎移植对结果胎儿突变频率的影响，我们允许小鼠自然交配，在原核阶段回收受精卵母细胞，并将其培养到Chatot，Ziomet和Bavister(CZB)(27)或Whitten培养基(28).CZB培养基是一种常用于涉及小鼠细胞的ART和克隆程序的培养基。Whitten的培养基先前被报道导致培养胚胎(表观遗传畸变的频率增加17，19)。然后，我们将双细胞或桑葚/囊胚阶段的培养胚胎转移到代孕母中，在10.5 dpc处恢复中期妊娠胎儿，并确定每种情况下的突变频率。为了确定IVF，ICSI或ROSI受孕对突变频率或谱的影响，我们遵循相同的方案，除了我们使用从成年雄性或雌性小鼠回收的配子在体外生成受精卵。图1总结了每类胚胎/胎儿的总体发育方案。