3种细胞裂解液提取总蛋白在Western blot中的效果分析

庞雅湘1，聂启昊2，刘晓宁3，王 帅3，冯 琦3，牛洪琳4*

(1.河北医科大学临床学院实验中心，河北 石家庄 050031;2.河北师范大学附属中学高中部,河北 石家庄 050017；3.河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017；4.河北医科大学第三医院肾内科，河北 石家庄 050051)

[摘要] 目的寻找一种适用于培养血管平滑肌细胞总蛋白提取的细胞裂解液配方，以更好地应用于Western blot分析。方法采用3种常用的细胞裂解液(Ⅰ液，Ⅱ液和Ⅲ液)，提取总蛋白后Bradford法测定蛋白含量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白，Western blot检测PDGFR-β、Akt、GAPDH和SM22α等不同分子量的蛋白表达情况。结果3种细胞裂解液得到的蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。小分子量蛋白(PP80 000)，细胞裂解液Ⅲ得到的光密度值高于细胞裂解液Ⅰ(PPPPP结论确定了一种裂解效果更好、能满足对不同分子量蛋白进行Western blot检测的裂解液配方，为以Western blot为主的蛋白检测相关研究提供了一定的参考。

[关键词] 肌细胞，平滑肌；细胞培养技术；细胞裂解液 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2019.03.004

免疫印迹法(Western blot)是一种将凝胶电泳和免疫化学分析相结合的杂交技术，是实验室中检测蛋白质表达与分布的最常用的一项分子生物学技术。蛋白样品的制备是Western blot应用中一个关键且易被忽视的环节，规范的样品处理过程，适合的裂解液配方可提高样品中蛋白含量及质量，最终直接影响Western blot结果的可靠性。目前提取蛋白所用的裂解液种类繁多，裂解液所用的缓冲体系、pH值、盐浓度、使用的表面活性剂、提取的温度以及加入的蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂等均会影响蛋白的提取效果，应用于后续的Western blot检测时效果具有较大的差异[1]。本研究以培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)入手，位于血管中膜的VSMC功能的变化与血管重构过程密切相关，血管重构是血管细胞增殖、坏死、迁移及细胞外基质合成、降解引起血管结构变化的动态过程[2-4]。培养的VSMC可作为理想的细胞模型用于研究高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等血管重构性疾病发生发展的病理生理过程[5]。故检测VSMC在生理和病理条件下相应蛋白表达变化对于一些重大疾病的防治具有十分重要的意义，将有助于加深对血管重构性疾病的病理生理过程的理解，为心血管疾病的防治提供有力的武器[4-5]。本研究通过比较文献报道的和本实验室常用的3种细胞裂解液对培养的VSMC总蛋白进行提取，Bradford法测定蛋白含量，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离提取的蛋白，Western blot检测不同分子量蛋白表达情况，从而确定一种裂解效果更好，能够满足Western blot对分子量不同、表达水平不同的VSMC总蛋白进行有效检测的细胞裂解液配方，旨在为以免疫印迹为主的蛋白质检测平台的相关研究提供一定的参考。

1.1 材料

1.1.1 实验动物及试剂 SD大鼠购自河北省实验动物中心，所有动物实验均遵循河北医科大学动物管理条例进行，实验过程中对动物的处理符合动物伦理学要求。血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)兔单克隆抗体(ab32570)和平滑肌22α(smooth muscle 22α，SM22-α)兔多克隆抗体(ab14106)购自Abcam公司(1∶1 000稀释)；丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt兔多克隆抗体(9272)和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔单克隆抗体(5174)购自Cell signaling公司(1∶1 000稀释)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记抗-兔IgG抗体(7074)购自Cell signaling公司(1∶2 000稀释)；蛋白酶抑制剂购自Roche Applied Sciences公司；Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶购自Gibco公司。

1.1.2 实验仪器 Centrifuge 5415D离心机(Eppendorf公司)，FRESCO 17低温离心机(Thermo公司)，CO2孵箱(Foma Scientific公司)，酶标仪(Thermo公司)，电泳仪，半干式蛋白质印迹转膜槽和发光显影仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC培养 SD大鼠行腹腔注射麻醉(25%乌拉坦，4 mL/kg体重)，仰卧位固定，无菌条件下，迅速分离胸腹主动脉，置入培养皿中；驱净血管腔内的凝血块，剥离血管外结缔组织和脂肪组织并剪去血管小分支；纵向剖开血管，剪成1～2 mm2组织块，贴至25 mL细胞培养瓶底面；加入2.5 mL DMEM培养基(含10 %胎牛血清)；培养瓶底面朝上，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，约2 h后正置培养瓶；其间勿动培养瓶，至72 h后更换新鲜培养基。待细胞生长汇合后应用0.25%胰蛋白酶消化传代，实验采用3～5代细胞进行[6]。

1.2.2 VSMC总蛋白提取 生长于C-100细胞培养皿中的细胞(106～107)用预冷的1×PBS(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4)洗涤3次，细胞重悬于350 μL细胞裂解液Ⅰ液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.1% SDS，1.0% Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA)[7-8]、Ⅱ液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.1% SDS，1.0% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA)[9]或Ⅲ液(150 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4，0.5% NP-40，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，pH 8.0，0.2 mmol/L Na3VO4，0.2 mmol/L PMSF)[10]，临用前加入蛋白酶抑制剂，冰浴30 min，其间每隔3 min涡旋振荡充分混匀细胞，使VSMC充分裂解。4 ℃，8 000 r/min离心10 min，收集裂解液上清，Bradford法进行蛋白定量。

1.2.3 考马斯亮蓝染色分析 各组样品均取15 μg总蛋白进行SDS-PAGE。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%，浓缩胶设定电压100 V进行电泳，待样品进入分离胶时提高电压至150 V，以彩色预染标准蛋白marker作指示，电泳至距胶底部0.5 cm左右停止电泳。取下凝胶，置于固定液中固定30 min，考马斯亮蓝R250染色30 min后，经脱色液多次脱色至背景干净为止。

1.2.4 Western blot分析 各组样品均取15 μg总蛋白进行SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，应用PDGFR-β、Akt、GAPDH和SM22α抗体孵育并与相应的二抗反应，化学发光法检测抗原抗体结合区条带，用Image-J软件对光密度值进行定量，对不同分子量的蛋白表达情况进行分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P

2.1 蛋白定量结果 3种细胞裂解液得到的蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3种细胞裂解液提取VSMC总蛋白浓度比较Table 1 Comparison of total protein concentrations in VSMC extracted from three kinds of cell lysates

组别 蛋白浓度 细胞裂解液Ⅰ1.085±0.117细胞裂解液Ⅱ0.976±0.134细胞裂解液Ⅲ0.926±0.184F值 0.103P值 0.904

2.2 SDS-PAGE电泳结果 考马斯亮蓝染色后凝胶上可见20 000～220 000均有蛋白条带分布，但不同细胞裂解液得到的蛋白质条带颜色深浅不一致(图1)。对于小分子量蛋白(PP80 000)的提取，细胞裂解液Ⅲ得到的光密度值高于细胞裂解液Ⅰ(P

2.3 Western blot结果 利用不同的抗体检测了3种细胞裂解液提取总蛋白中PDGFR-β、Akt、GAPDH和SM22α的表达变化。无论是高分子量的膜蛋白PDGFR-β(190 000)还是小分子量的SM22α(约22 000)，3种裂解方法均可满足Western blot检测蛋白的要求(图2)。对于PDGFR-β，细胞裂解液Ⅱ和细胞裂解液Ⅲ所检测到的条带光密度值显著高于细胞裂解液Ⅰ(PPPP

图1 3种细胞裂解液提取VSMC总蛋白SDS-PAGE比较 图2 3种细胞裂解液提取VSMC总蛋白Western blot结果

Figure 1 SDS-PAGE of total protein in VSMC extracted from three kinds of cell lysates Figure 2 Western blot of total protein in VSMC extracted from three kinds of cell lysates

表2 SDS-PAGE光密度值分析Table 2 Optical density analysis for SDS-PAGE

组别 80 000细胞裂解液Ⅰ119.474±35.046932.113±285.662709.276±175.126细胞裂解液Ⅱ463.107±264.870∗2142.453±446.512∗1 080.809±129.761细胞裂解液Ⅲ732.054±113.173∗3644.189±387.063∗#1 506.675±315.706∗F值 10.07838.5649.736P值 0.0120.0000.013

*P值P值q检验)

表3 Western blot结果光密度值分析Table 3 Optical density analysis for Western blot assay

组别 PDGFR-βAktGAPDHSM22α细胞裂解液Ⅰ98.732±22.57856.611±10.462375.378±25.05060.903±6.636细胞裂解液Ⅱ220.332±30.615∗98.314±9.598∗696.266±103.884∗119.370±10.705∗细胞裂解液Ⅲ206.128±47.701∗153.558±16.962∗#517.098±97.218#63.553±10.394#F值 10.37843.49711.15136.787P值 0.0110.0000.0090.000

*P值P值q检验)

培养的VSMC作为一种理想的细胞模型用于研究血管重构性心血管疾病发生发展的病理生理过程，检测相应蛋白表达变化对于VSMC功能的影响揭示心血管疾病的分子机制具有十分重要的研究意义[4-5]。对于蛋白质表达的研究，Western blot作为实验室最常用的一种技术被广泛采用，在对于不同蛋白的免疫印迹检测过程中，有效提高样品的蛋白总浓度以及促进细胞不同部位目标蛋白的释放是改善实验结果的常用策略，同样也是提高目标蛋白检测效率的关键步骤。在这一环节尽管有多种裂解液配方可供选择，但是并不存在普遍应用的适合所有细胞或组织的裂解液配方，根据细胞或组织的不同可选择不同的裂解液配方。因此，适合的裂解液配方一定是依据样品中待测靶蛋白的种类、分子量大小、分布的位置以及表达量高低的差异进行优化，是最终获得可靠的Western blot结果的首要前提。

本研究以培养的VSMC作为研究对象，应用了3种不同盐浓度、不同表面活性剂组合的细胞裂解液处理细胞，其所得到的蛋白样品含量，通过Western blot分析，提供优化的蛋白提取方法以期为后续的基于Western blot相关的VSMC蛋白质功能研究提供思路。本研究采用的细胞裂解液Ⅰ采用的是常用的RIPA裂解液配方，包括缓冲体系Tris-HCl(pH7.4)、等渗体系NaCl(150 mmol/L)、SDS(强离子表面活性剂，0.1%)、Triton X-100(非离子型表面活性剂，1 %)以及蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA等。细胞裂解液Ⅱ和细胞裂解液Ⅲ的配方中改变了缓冲体系的pH值、离子强度和采用了更温和的NP-40替代Triton X-100，在裂解液中表面活性剂使用的种类和浓度对细胞的裂解效率以及不同亚细胞定位的蛋白释放至关重要，可直接影响样品蛋白提取的质量。但细胞的裂解和蛋白完整性的破坏是一对矛盾，采用强效的表面活性剂在提高细胞裂解效率的同时也增加了蛋白完整性破坏的概率。细胞裂解液Ⅰ配方中采用Triton X-100和SDS组合裂解细胞，在提高蛋白裂解效率的同时可能导致了部分蛋白尤其是小分子蛋白的降解，SDS-PAGE显示的细胞裂解液Ⅰ提取的小分子量蛋白(

蛋白定量的常用方法主要有凯氏定氮法、Bradford法、BCA法、Lowry法、双缩脲法和紫外分光光度法等。其中，Bradford法和BCA 法是最常使用的2种蛋白质定量方法，但这2种方法所得到的蛋白定量结果均会受到裂解液表面活性剂的影响，如配方中含有CHAPS、SDS、Triton X-100等成分可提高Bradford法所得到的蛋白定量值，螯合剂EDTA 和EGTA等的使用可降低BCA法的定量值。本研究采用了Bradford法作为样品蛋白含量的测定方法，结果显示3种裂解液提取的蛋白含量分布均一；应用于Western blot检测不同分子量蛋白的表达，可见3种细胞裂解液均可满足蛋白的免疫印迹研究要求，但是样品的SDS-PAGE所得到的条带与Western blot检测出的条带并不完全一致，对于小分子量蛋白(

从细胞和组织提取蛋白是研究蛋白质功能的关键一步，但往往是最容易被忽视的一点，不同的检测方法要求不同的裂解液配方，裂解液配方的不同直接影响后续实验的灵敏度和分辨率。因此，对于VSMC的裂解及Western blot分析蛋白表达时宜采用细胞裂解液Ⅱ，该结果将为免疫印迹分析方法为主的VSMC相关蛋白功能的检测奠定坚实的工作基础。

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PANG Ya-xiang1, NIE Qi-hao2, LIU Xiao-ning3, WANG Shuai3, FENG Qi3, NIU Hong-lin4*

(1.Department of Experimental Center， the School of Clinical, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, China; 2.Department of High School, Attached Middle School of Hebei Normal University, Shijiazhuang 050017, China; 3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，the School of Basic Medicine， Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 4.Department of Nephrology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, China)

[Abstract] Objective To find a cell lysate suitable for total protein extract from cultured vascular smooth muscle cells for better application in Western blot analysis. Methods Three commonly used cell lysates, solution Ⅰ, solution Ⅱ and solution Ⅲ supplement with protease inhibitors were used to extract total protein from cultured vascular smooth muscle cells. Bradford method was used to determine protein content and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) was used to isolate protein. And then, Western blot was used to detect the protein expression of PDGFR-β, Akt, GAPDH and SM22α. Results There was no significant difference in protein concentration among the three cell lysates(P>0.05). The optical density values obtaining from cell lysate Ⅱ and Ⅲ were higher than that obtained from cell lysate Ⅰ in small molecular weight proteins(80 000) detection. For Western blot, the band optical density of PDGFR-β detected by cell lysate Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that obtained from cell lysate Ⅰ. The band optical density of Akt detected by cell lysate Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that obtained from cell lysate Ⅰ, and the band optical density of Akt detected from cell lysate Ⅲ was significantly higher than that obtained from cell lysate Ⅱ. The band optical density of GAPDH detected from cell lysate Ⅱ was significantly higher than that obtained from cell lysate Ⅰ and Ⅲ, the band optical density of SM22α detected fromcell lysate Ⅱ was significantly higher than that obtained from cell lysate Ⅰ and Ⅲ(PConclusion An optimal cell lysate was selected to detect the different molecular weight protein from cultured vascular smooth muscle cells, which could provide a suitable protocol for the study of protein function based on Western blot assay.

[Key words] myocytes, smooth muscle； cell culture techniques； cell lysatessolution

[中图分类号]R394.24

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2019)03-0263-05

[收稿日期]2018-09-26；

[修回日期]2018-10-23

[基金项目]国家自然科学基金项目(81600576)

[作者简介]庞雅湘(1979-)，女，湖南南县人，河北医科大学临床学院实验师，医学硕士，从事实验中心管理研究。

*通信作者。E-mail：[email protected]

(本文编辑：赵丽洁)