一文学习Luciferase（最全）

基本实验步骤：

1、实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于 35 mm 细胞培养皿，置于 5％ CO2、饱和湿度的 37℃培养箱内培养过夜。

2、等细胞密度达到70％时用 Luciferase 报告基因质粒、LacZ 的表达质粒及其 它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞（根据具体实验选择转染方法，如磷酸钙沉淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可）。

3、转染 24－36 小时后，吸去培养液，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗 涤除去含钙介质。

4、在每个培养皿中加入 350 μl 预冷的 harvest buffer，于 4℃ 或冰上放置 10 min 裂解细胞。

5、在细胞裂解期间，准备足量的1.5 mL 微量离心管，将 ATP buffer 与 luciferin buffer 以 1：3.6 比例混合成反应液后分装，每管 100 μl。

6、依次取等体积的细胞裂解液（100 μl）至步骤 5 中的离心管中，迅速混匀，在 发光仪（Luminometer）上读取吸光值。注：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后 5 秒内必须读取吸光值。

7、确保以相同操作手法读取全部样品吸光值后。

8、取剩余裂解液测定 LacZ 的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。

9、用矫正后的读数作图，分析数据。注：荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。

实验试剂：

（1）harvest buffer (25 ml)：1.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 25 μl 1 M DTT, 250 μl 10% Triton X-100, 加水 至 25 ml，4℃ 保存。（2）ATP buffer (10 ml)：1.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 250 μl 1 M MgCl2, 24 mg ATP, 加水至 10 ml -20℃ 保存。

（3）luciferin buffer (36 ml)：10 mg luciferin, 36 ml 5 mM KH2PO4 (pH 7.8), 4℃ 保存。

（4）PBS: 20 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4, 4℃保存。

注意事项：

1、为取得最佳测定效果，在用单管的荧光测定仪测定时，样品和测定试剂混合后到测 定前的时间应尽量控制在相同时间内，例如 30 秒内。

2、由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

3、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免 反复冻融和长时间暴露于室温。一般来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结 果无明显影响。

4、样品和测定试剂混合后，必须等待 1-2 秒，再进行测定。测定时间通常为 10 秒，根 据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。

5、为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入 Renilla 荧光素酶 的报告基因质粒作为内参，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测;也可以同时转入 β-半乳糖甘酶报告基因质粒作为内参，然后采用β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒进行检 测。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒中的报告基因细胞裂解液裂解获得的样品，可以直接 用于β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒中的测定。

浅谈Luciferase报告基因在构建药物筛选细胞模型中的应用

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具，被广泛应用于基因表达调控、信号转导、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域。

可用于报告基因的基因有很多，氯霉素乙酰基转移酶基因(chlormnphenicol acetyltransferase，CAT)，β-半乳糖苷酶基因（β-gal），β-葡萄糖苷酸酶基因（β-gus），新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因（NPT Ⅱ），分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP），以GFP为代表的荧光蛋白家族基因，以luciferase为代表的荧光素酶基因。

不同报告基因特点及应用对比整理如下：

无论是从灵敏度，还是检测的便捷性等角度考虑，luciferase都是不错的选择。此外，从signal机制角度考虑，针对不同的靶点，还应选择不同的信号分析方法。

常见靶标分类及信号分析方法整理对比如下：

以下主要从这些靶标的角度出发，讲讲各类靶标都可以构建哪些基于luc的报告基因。

1.信号转导

信号转导其实是相当宽泛的概念了，比如几乎所有免疫检查点靶点靶向药筛选用的细胞模型都是基于相应靶点的信号转导机制，并且大部分最终在信号通路层面都会归于NFAT或NFκB，如H_CD40(TNFRSF5) NFKB-Reporter Jurkatcell line，H_TNFRSF9(4-1BB)NFKB-Reporter Jurkat cell line，H_PD-1/NFATReporter Jurkat Cell Line等等

甚至于研究发现经典的ADCC/ADCP效应也可通过ADCCFcγRIIIa(158V/F) Jurkat Effector Cell Line, ADCPFcγRIIa Jurkat Effector Cell Line这样的传代工具细胞系来检测。

除此之外，IL10，IL12等白细胞介素类，VEGF，TGFbeta等靶点，信号通路机制早已研究清楚，使用293或CHO-K1作为parent cell，表达相应靶点受体及下游报告基因即可得到有效的cell line.

2.GPCR（Ca/cAMP/电压）

之所以把Ca/cAMP/电压这三个放一起，是因为这三个都是GPCR靶点筛选相关的重要指标。然而，无论是检测钙流，cAMP还是电压，从设备要求/操作便捷性以及通量考虑，直接检测都不是非常好的选择。幸运的是，多数GPCR靶点基于G蛋白的通路机制研究已比较清楚，目前靶向GCPR的高通量药物筛选方法主要可分为G蛋白依赖的功能分析和非G蛋白依赖的功能分析。GPCR按G蛋白，可以分为4类，Gαs，Gαi，Gαq和Gα12/13,基本都可归到不同通路，即可构建报告基因，值得一提的是，该细胞系既可用监测钙流的方法检测，还可用luc方法检测。非G蛋白依赖的功能分析，主要利用了几乎所有的GPCR都能诱导β-arrestin易位的原理，当GPCR激活时，细胞中分散的arrestin蛋白，会被招募到GPCR受体上。这一过程不依赖G蛋白，可用于孤儿受体等未研究清楚的GPCR药物研发。具有高灵敏性，高重复性，特别适合GPCR靶标和先导化合物筛选。

GCPR的高通量药物筛选原理

吉满生物科技（上海）有限公司，是一家专业从事生物科技前沿技术研发的高新技术企业。公司成立于2011年，多年来一直致力于基于慢病毒的各类稳定细胞系开发，包括过表达细胞系构建，干扰或敲除细胞系构建以及基于luciferase报告基因的功能类细胞系构建，现有百余种现货细胞系，同时可根据不同靶点提供研发定制服务。

部分现货细胞系

参考文献

1.张禾璇，单可人，官志忠。报告基因研究及其应用进展。国际遗传学杂志，2013，Feburary,Vol.36.

2.孙哲，吕秋军。基于检测报告基因的药物筛选方法研究进展。中国药学杂志，2000,August,Vol.35

3. Yao-Te Hsieh, Poonam Aggarwala, David Cirellib, et al. Moziera Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells. Journal of Immunological Methods, Volume 441, February 2017.

综合自生物制药小编、医福会等，仅用于学术分享

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